楊曉宇，李程，馬思躍,李建恒

(1.河北大學 藥學院，河北 保定 071002；2.愛荷華大學 工程學院，愛荷華市 52240)

Box-Behnken法優(yōu)化加酸超聲提取瞿麥中大黃素的工藝

楊曉宇1，李程2，馬思躍1,李建恒1

(1.河北大學 藥學院，河北 保定 071002；2.愛荷華大學 工程學院，愛荷華市 52240)

采用響應面法優(yōu)化瞿麥中大黃素的提取工藝.利用單因素法進行考察，以大黃素提取量為指標，考察液固比、超聲時間、溫度、鹽酸質(zhì)量分數(shù)及用量對大黃素提取量的影響，并結(jié)合Design-Expert軟件中的Box-Behnken實驗設計和響應面分析方法對超聲提取瞿麥中大黃素的工藝進行優(yōu)化，再與藥典中虎杖提取大黃素方法進行比較，確定大黃素超聲提取最佳工藝：液固比為61倍，溫度為40 ℃，超聲30 min，加質(zhì)量分數(shù)為8%的鹽酸1 mL.通過優(yōu)化得到的大黃素超聲提取工藝省時，穩(wěn)定，且與回流法相比提取量高.

大黃素；超聲提?。豁憫娣?/p>

超聲提取法是以機械作用、熱學作用及空化作用等原理為基礎，利用超聲波產(chǎn)生的擾動、擊碎和攪拌等功能，增強了物質(zhì)的分子運動頻率和速度，使被提取的成分加速進入溶劑，且在超聲過程中產(chǎn)生的熱量還起到了一定的加熱作用，進而達到快速提取的效果.超聲提取法與傳統(tǒng)乙醇回流提取法相比，避免了耗時長、試劑浪費等問題，極大地提高了提取效率，避免了高溫對提取成分的影響，因此值得廣泛使用[1].

瞿麥臨床療效廣泛，主要用于治療熱淋、血淋、小便不通和經(jīng)閉瘀阻等病癥；現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)瞿麥還具有免疫、抑菌、抗脂質(zhì)過氧化、抗肝病毒等作用[2-3].大黃素是瞿麥的主要有效成分之一，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗腦缺血損傷等作用[4].有研究表明[5]大黃素在植物體內(nèi)以鹽的形式存在，加酸可使之游離出來，進而提高大黃素的提取率，且藥典中對于瞿麥有效成分含量的測定并沒有明確的規(guī)定，對其藥品質(zhì)量評價帶來一定難度.本文采用加酸超聲提取法對瞿麥中大黃素進行提取，且采用單因素實驗及Box-Behnken法進行實驗設計，通過響應面分析法對大黃素的提取工藝進行優(yōu)化，并通過與藥典中虎杖提取大黃素的方法進行對比，以確定大黃素的最佳提取條件，為瞿麥中大黃素的測定和質(zhì)量評價標準提供理論依據(jù).

1 材料

北京創(chuàng)新通恒LC3000高效液相色譜儀，Apollo C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

甲醇、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純；超純水(自制)；大黃素對照品(批號20160302，上海金穗生物技術有限公司)；瞿麥(產(chǎn)地河北，經(jīng)龍海大藥房張藥師鑒定).

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃素定量測定方法的建立[1,5-7]

2.1.1 色譜條件

采用北京創(chuàng)新通恒高效液相色譜儀，Apollo C18(4.6mm×150 mm,5 μm)色譜柱；流動相為甲醇-(質(zhì)量分數(shù)為0.1%)磷酸(體積比為76∶24)，檢測波長為254 nm，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min，理論塔板數(shù)按大黃素峰計算應不低于3 000.

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取大黃素對照品1.49 mg，加甲醇制成每1 mL含149 μg的溶液，即得.

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取本品粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇29.5 mL，質(zhì)量分數(shù)為8%的鹽酸1 mL，密塞，40 ℃，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，減壓回流至10 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得.

2.1.4 線性關系觀察

分別精密量取對照品溶液0.5、2、5、7、10、14、16、18、20 μL進樣.按上述色譜條件進樣測定，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行線性回歸，繪制標準曲線，得回歸方程Y=330 32X，r=0.999 1；結(jié)果表示進樣量在0.730～29.204 μg內(nèi)線性關系良好.

2.1.5 精密度考察

精密量取上述對照品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣6次，每次20 μL，測得大黃素峰面積積分值的RSD為0.12%，表明精密度良好.

2.1.6 穩(wěn)定性考察

取同一供試品約0.50 g，按2.1.3項制備成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、18、24 h時進樣，每次20 μL，測的大黃素峰面積積分值RSD為1.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.1.7 重復性考察

取同一批瞿麥樣品0.50 g，按2.1.3項分別平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，每次20 μL，測定大黃素峰面積積分值RSD為1.3%，表明本測定方法重復性良好.

2.1.8 回收率考察

精密稱取已知含量的同一批瞿麥樣品9份，每3份一組，每組分別精密加入1.49 mg的對照品，按2.1.3中方法制備并測定含量，結(jié)果見表1，平均回收率為98.29%，RSD為1.0%(n=9).

表1 大黃素加樣回收率

2.2 大黃素提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗

精密稱取瞿麥適量，分別加入不同液固比的甲醇，不同質(zhì)量分數(shù)及用量的鹽酸，在特定溫度下，超聲提取一定時間，減壓回流至10 mL，過濾，取續(xù)濾液，以大黃素提取峰面積為指標，選取液固比、酸濃度及用量、提取時間、溫度等5個因素進行單因素實驗.

2.2.2 響應面分析優(yōu)化提取工藝

綜合單因素實驗結(jié)果，選取對大黃素提取含量影響較大的液固比、酸濃度及用量3個因素，利用Box-Behnken實驗設計對提取工藝進行優(yōu)化設計實驗.通過Design Expert軟件，對提取工藝進行響應面分析，得到最佳工藝參數(shù).

2.3 藥典法提取瞿麥中大黃素

參考藥典中大黃素的提取方法，稱取瞿麥粉末(過三號篩)約0.5 g，精密量取三氯甲烷25 mL和2.5 mol/L硫酸溶液20 mL，稱定重量，置80 ℃水浴中加熱回流2 h，冷卻至室溫，再稱定重量，用三氯甲烷補足減失的重量，搖勻.取三氯甲烷層溶液，精密量取10 mL，蒸干，殘渣加甲醇使其溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得[2].

表2 Box-Behnken因素水平設計

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗

3.1.1 液固比對大黃素提取含量的影響

固定超聲時間20 min，溫度40 ℃，質(zhì)量分數(shù)為3%的鹽酸1 mL，考察液固比為20、30、40、50、60倍對大黃素提取量的影響.當液固比由20倍增加至60倍時，大黃素含量隨液固比增加而增加，并在液固比為60倍時達到最大，且增幅加大，見圖1.隨著液固比增加，使溶液的不飽和度增加，有助于大黃素的溶出，但溶液過多會使雜質(zhì)溶出增加，影響提取效果.因此實驗選擇液固比55～65倍為響應面分析范圍.

3.1.2 鹽酸質(zhì)量分數(shù)對大黃素提取含量的影響

固定液固比為20倍，超聲時間20 min，溫度40 ℃，質(zhì)量分數(shù)不同的鹽酸1 mL，考察質(zhì)量分數(shù)為0%、3%、6%、8%、10%的鹽酸對大黃素提取量的影響，見圖2.隨著鹽酸質(zhì)量分數(shù)的增加，大黃素含量先增加后減少，在8%時達到最大.這可能是由于鹽酸質(zhì)量分數(shù)過高反而使大黃素的結(jié)構(gòu)遭到了破壞.因此實驗選擇質(zhì)量分數(shù)為7%～9%的鹽酸作為響應面分析范圍.

圖1 液固比對大黃素含量的影響Fig.1 Liquid-material ratio to the influence of emodin content

圖2 鹽酸質(zhì)量分數(shù)對大黃素含量的影響Fig.2 Mass fraction of hydrochloric acid to the influence of emodin content

3.1.3 酸用量對大黃素提取含量的影響

固定液固比為20倍，超聲時間20 min，溫度40 ℃，質(zhì)量分數(shù)為3%的鹽酸，考察酸用量為0、1、2、3、4 mL時對大黃素提取量的影響，見圖3.當酸用量由0增加至1 mL時，大黃素含量隨用量增加而增加，在1 mL時達到最大，而后逐漸降低.這可能是由于隨著酸用量的增加結(jié)合型大黃素與酸結(jié)合游離溶解的同時，其他結(jié)合型物質(zhì)的溶解量也逐漸增加，進而使大黃素含量減少.因此選擇酸用量0.5～1.5 mL為響應面分析范圍.

3.1.4 超聲時間對大黃素提取含量的影響

固定液固比為20倍，溫度40 ℃，質(zhì)量分數(shù)為3%的鹽酸1 mL，考察超聲時間為10、20、30、45、60 min時對大黃素提取量的影響.大黃素的含量隨著超聲時間的增長先升高再降低，這可能是由于隨著超聲時間的增長大黃素已經(jīng)基本提取完全，時間過長可能會使雜質(zhì)溶出增加，且大黃素的結(jié)構(gòu)可能會遭到破壞.提取含量在超聲時間為30 min時達到最大，隨后降低趨勢并不顯著，因此為了節(jié)省時間，選擇30 min為最佳提取時間.

圖3 酸用量對大黃素含量的影響Fig.3 Dosage of hydrochloric acid to the influence of emodin content

圖4 超聲時間對大黃素含量的影響Fig.4 Ultrasound time to the influence of emodin content

3.1.5 溫度對大黃素提取含量的影響

固定液固比20倍，超聲時間20 min，質(zhì)量分數(shù)為3%的鹽酸1 mL，考察溫度為30、40、50、60、70 ℃時對大黃素提取量的影響，見圖5.大黃素的含量隨溫度的增高先升高后降低，并在溫度為40 ℃時達到最大.這可能是由于隨著溫度升高，大黃素的游離、溶解速度加快，使其容易被提取出來，但溫度過高可能會使大黃素氧化，進而降低其含量，但由圖5可看出，40 ℃后的大黃素的峰面積雖然減小但趨勢緩慢，降低并不明顯，因此為了方便操作，選擇40 ℃為最佳溫度.

圖5 溫度對大黃素含量的影響Fig. 5 Temperature to the influence of emodin content

3.2 大黃素提取響應面法優(yōu)化分析

3.2.1 建立模型及顯著性檢驗

根據(jù)Box-Behnken設計進行實驗，共設計了17個實驗點，設計及結(jié)果如表3.

表3 瞿麥提取工藝設計表及大黃素提取量

利用Design-expert軟件，對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，選擇相應值顯著的各項，可得液固比(A)、鹽酸質(zhì)量分數(shù)(B)、鹽酸用量(C)與大黃素提取量的二次多項回歸方程，回歸方程為：大黃素提取量=-101.359 89+2.196 03A+7.762 08B+10.642 84C-0.022 584AB-0.121 29AC+0.018 231BC-0.015 321A2-0.38 537B2-1.513 12C2，回歸方程高度顯著，相關系數(shù)R2=0.933 5，說明實驗方法可靠.

P值表示模型及各考察因素的顯著性，如表4，以大黃素提取量為響應值時，模型的P值為0.002 3<0.01，而失擬項P值為0.731 3>0.1000，則說明該二次方程模型極顯著，且實驗結(jié)果與數(shù)學模型擬合良好，可用該數(shù)學模型推測實驗結(jié)果.還可知A、B、C、AC、A2、B2、C2各項對大黃素提取量的影響均顯著，表明二次項對響應值也有很大關系，但交互作用的影響相對較小.故回歸方程可較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定3個參數(shù)的最佳水平.

表4 響應面ANOVA分析

3.2.2 響應面交互作用分析優(yōu)化

圖6 液固比和鹽酸質(zhì)量分數(shù)對大黃素提取量的響應面和等高線Fig.6 Contour line and curved surface of response of liquid- solid ratio and mass fraction of hydrochloric acid to emodin content

通過對各考察因素之間的交互作用進行響應面分析，繪制響應面曲線圖及等高線圖，見圖6-8.圖6是液固比與鹽酸質(zhì)量分數(shù)對大黃素提取量的交互作用，可知隨著液固比與鹽酸質(zhì)量分數(shù)的增加，兩者之間存在增效作用，大黃素提取量隨著兩者的增加而提高；但當液固比增加到61倍，鹽酸質(zhì)量分數(shù)增加到8.5%左右時，大黃素提取量隨兩因素的增加而降低；圖7中當液固比在55～61倍，鹽酸用量在0～1.1 mL時，曲面圖中的曲線坡度較陡，兩者存在顯著的增效作用，在此范圍內(nèi)大黃素提取量隨兩者的增加先升高，而后曲線趨于平緩；圖8中鹽酸用量在0～1.1 mL時，曲線先緩慢上升后下降，鹽酸質(zhì)量分數(shù)在7%～8%時，曲線上升且坡度較陡，而后下降但坡度平緩.

綜上所述，曲面圖的曲線越陡，該因素對大黃素提取率影響越大[8]，等高線越接近橢圓形代表兩因素間交互作用顯著，而存在極值的條件應該在圓心處[8-9].可看出圖7的曲線最為陡峭，等高線接近橢圓形；圖8中曲線最平坦，趨近直線，等高線接近圓形.因此得出液固比與酸用量之間的交互影響最大，而酸濃度與用量之間的交互影響最小，與ANOVA分析結(jié)果吻合.

圖7 液固比和鹽酸用量對大黃素提取量的響應面和等高線Fig.7 Contour line and curved surface of response of liquid- solid ratio and dosage of hydrochloric acid to emodin content

圖8 鹽酸質(zhì)量分數(shù)和用量對大黃素提取量的響應面和等高線Fig.8 Contour line and curved surface of response of mass fraction of hydrochloric acid and dosage to emodin content

3.2.3 驗證實驗

由各響應面立體圖可知，響應值存在最大值.由分析結(jié)果得出各因素的最佳取值為液固比為61.13倍，鹽酸質(zhì)量分數(shù)為8.31%，用量為1.12 mL，模型預測大黃素的最高提取量是3.93 mg/g.根據(jù)實際生產(chǎn)的現(xiàn)狀，將以上參數(shù)進行優(yōu)化，最終得到的超聲提取大黃素的工藝：液固比為61倍，鹽酸質(zhì)量分數(shù)為8%，用量為1 mL，并在此條件下重復3次實驗，瞿麥中大黃素的實際平均提取量為3.87 mg/g，與理論預測值的相對誤差為1.5%.因此，響應面對瞿麥中大黃素提取條件的優(yōu)化是可行的.

3.3 與藥典法進行對比

為了驗證優(yōu)化工藝的優(yōu)越性，與藥典中虎杖提取大黃素的方法進行比較.由圖9可知，同一樣品使用加酸超聲法可大大縮短提取時間，還可以顯著提高瞿麥中大黃素的提取量，且在單因素實驗中也體現(xiàn)出了加入鹽酸的優(yōu)越效果.

處理工藝圖9 優(yōu)化工藝與傳統(tǒng)工藝比較Fig.9 Comparison table of extracting between optimization process and traditional process

4 結(jié)論

在單因素的基礎上進行響應面實驗，通過實驗結(jié)果分析確定了最佳提取條件：液固比為61倍，超聲時間30 min，40 ℃，質(zhì)量分數(shù)為8%的鹽酸1 mL，在此條件下大黃素提取量與預測值基本相符，并與藥典中虎杖提取大黃素的方法進行對比.最終表明加酸超聲提取法是可以應用于提取瞿麥中大黃素的方法，為其資源的進一步開發(fā)提供理論基礎.

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(責任編輯：梁俊紅)

Optimization of ultrasound extraction technology with acid of emodin from herba dianthi by response surface methodology

YANG Xiaoyu1, LI Cheng2, MA Siyue1, LI Jianheng1

(1.College of Pharmaceutical Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China; 2.College of Engineering, The University of Iowa, Iowan 52240, America)

Response surface methodology was used to optimize the optimal ultrasound extraction technology of emodin from herba dianthi.With the amount of extraction of emodin as an indicator, single-factor test was used to investigate the effect of ethanol volume fraction, solid-liquid ratio, ultrasound time, temperature, mass fraction of hydrochloric acid and dosage on the amount of extraction of emodin.The results were combined with Box-Benhken design of design-expert software and response surface analysis to optimize the technology parameters for extraction process of herba dianthi, and compare with extraction technology of emodin from Polygonum cuspidatum in the Pharmacopoeia.Obtain the optimal ultrasound extraction technology under the following conditions: liquid- solid ratio was 61, 40 ℃，30 min, hydrochloric acid mass fraction 8%, 1 mL.Ultrasound extraction technology of emodin by response surface methodology is time-saving, stable, and the amount of extraction is higher than condensation reflux method.It’s provide theoretical basis for quality evaluation of Dianthus superbus.

emodin; ultrasound extraction technology; response surface methodology

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.04.007

2016-11-14

河北大學自然科學研究計劃項目(3333112)

楊曉宇(1992—)，女，河北邯鄲人，河北大學在讀碩士研究生.E-mail: 792033491@qq.com

李建恒(1964—)，男，河北保定人，河北大學教授，主要從事中藥藥理方面的研究.E-mail：lijianheng@hbu.cn

R917

A

1000-1565(2017)04-0369-09