王潤錦，陳 羲，馬金英

（1.西藏自治區(qū)山南市畜牧獸醫(yī)總站，西藏 乃東 856100；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009）

川藏公路拉薩-林芝沿線藏豬副豬嗜血桿菌病的病原分離鑒定與耐藥性調(diào)查

王潤錦1，陳 羲1，馬金英2

（1.西藏自治區(qū)山南市畜牧獸醫(yī)總站，西藏 乃東 856100；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009）

根據(jù)拉薩-林芝公路沿線藏豬副豬嗜血桿菌血清抗體流行狀況，在針對拉薩-林芝公路沿線12鄉(xiāng)鎮(zhèn)藏豬的間接血凝抗體ELISA檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，成功分離到藏豬副豬嗜血桿菌的菌株，并篩選出敏感藥物。分離株對氟苯尼考、環(huán)丙沙星為高度敏感，對恩諾沙星、磺胺嘧啶、青霉素G、慶大霉素中度敏感，對氨芐西林不敏感，有很強(qiáng)的耐藥性。

藏豬；副豬嗜血桿菌；病原；耐藥性；拉薩-林芝公路沿線

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）是豬體內(nèi)的常在菌，屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬。能引起斷奶保育仔豬為主的消瘦、呼吸困難、多發(fā)性纖維素性胸膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、腦膜炎等為特征的典型細(xì)菌性傳染病，伴隨病程的延長，此病已經(jīng)逐漸向成年豬群蔓延，可以造成母豬流產(chǎn)、公豬跛行等[1-2]。故本病又稱多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，為豬革拉澤氏病（Glasser's Disease）的病原菌[3]，根據(jù)拉薩-林芝公路沿線藏豬副豬嗜血桿菌血清抗體流行狀況[4]，筆者針對拉薩-林芝公路沿線12鄉(xiāng)鎮(zhèn)藏豬在間接血凝抗體ELISA檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，成功分離到藏豬副豬嗜血桿菌的菌株，并篩選出敏感藥物。結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2016年7—10月，以拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉(xiāng)、章多鄉(xiāng)、甲瑪鄉(xiāng)、工卡鎮(zhèn)、扎西崗鄉(xiāng)、日多鄉(xiāng)、加興鄉(xiāng)、金達(dá)鎮(zhèn)、巴河鎮(zhèn)、百巴鎮(zhèn)、更章門巴民族鄉(xiāng)、八一鎮(zhèn)為采樣點，先后無菌采集到具有明顯呼吸道病癥狀的病發(fā)藏豬血液（5 mL）、肺臟組織、胸腔積液、心包液等病料57頭份。

將采集血液凝固后離心分離血清并標(biāo)記，置-20℃保存，最后低溫送實驗室于-70℃保存?zhèn)錂z。

1.1.2 主要設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（SK WJ-160B-II）、超凈工作臺（GH-GZTU-ZW）等。

1.1.3 主要試劑 副豬嗜血桿菌間接血凝抗體ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）檢測試劑盒購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

馬血清美國HyClone公司生產(chǎn)；鹽酸萬古霉素為西安國安生物科技有限公司產(chǎn)品；NAD BIOSHARP公司生產(chǎn)。

NAD溶液：稱取50 mg NAD溶于1 mL去離子水中，混勻即成。

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA），購于杭州百思生物技術(shù)有限公司。稱取胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（大豆消化酪素瓊脂培養(yǎng)基）40 g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15 min。待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時加入100 μL NAD溶液于10 mL馬血清?；靹蚝蟮拱濉?/p>

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），購于杭州百思生物技術(shù)有限公司。取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基29.8 g，加1L純化水，加熱溶解，分裝。121℃高壓滅菌15min。待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時加入100 μL NAD溶液于10 mL馬血清?；靹蚝蟮拱?。

普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。稱取營養(yǎng)肉湯粉末18 g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15 min，待冷至常溫，備用。

D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、硝酸鹽還原等生化培養(yǎng)皿均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 陽性個體篩選 參考副豬嗜血桿菌間接血凝抗體ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）檢測試劑盒說明書，將PBS緩沖液加入V型反應(yīng)板各孔中，每孔25 μL；取被檢血清25 μL加入第1孔中，與PBS混勻后吸25 μL加于第2孔，依次做倍比稀釋至第4孔；每孔加抗原25 μL，另設(shè)陰性、陽性血清對照。加完后將反應(yīng)板至微型振蕩器上震蕩1～2 min，直至診斷液中血球分布均勻，從振蕩器上取下反應(yīng)板，蓋上一塊與反應(yīng)板大小相近的玻璃片，置37℃下2～3 h后觀察并登記陽性結(jié)果。

1.2.2 病原的分離 根據(jù)間接血凝抗體ELISA檢測陽性結(jié)果，針對對應(yīng)的發(fā)病藏豬病料無菌處理后直接在TSA培養(yǎng)基上劃線接種，于5%CO2環(huán)境下37℃培養(yǎng)24～48 h后挑取灰白色透明可疑菌落接種于含有NAD和血清的TSB培養(yǎng)基中，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.3 染色鏡檢 挑取上述純培養(yǎng)后的菌落涂片，按照常規(guī)革蘭氏染色法后鏡檢。將其中革蘭氏陰性具有兩極濃染的短小桿菌進(jìn)行接觸酶試驗，接觸酶試驗陽性的，初步判斷為副豬嗜血桿菌。

1.2.4 生化鑒定 在無菌操作臺上，挑取上述可疑單個菌落接種于含有NAD與血清的TSB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，吸取0.1 mL菌液于不含NAD的普通瓊脂平板上，用滅菌涂布棒均勻涂布，然后挑取金黃葡萄球菌在平板上“井字”劃線，于5%CO2環(huán)境下37℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察是否有金黃葡萄球菌周圍待檢菌落生長良好且密集，而遠(yuǎn)處菌落生長較差，較稀疏，甚至不生長；同時觀察是否有溶血現(xiàn)象。

挑取具有金黃葡萄球菌周圍待檢菌落生長良好且密集，而遠(yuǎn)處菌落生長較差，較稀疏，甚至不生長，不溶血的單個菌落接種于加有5%的血清與NAD的D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、硝酸鹽還原等生化培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗 氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考、磺胺嘧啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素和青霉素G 7種藥由西藏牧樂農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

將篩選的副豬嗜血桿菌接種到TSA培養(yǎng)基中，于5%CO2濃度下37℃培養(yǎng)24 h，挑菌落，接種于TSB培養(yǎng)基，用麥?zhǔn)媳葷岱?，將菌液稀釋至濃度約為1.5×109cfu。按照常規(guī)藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作，并根據(jù)抑菌圈直徑（Ф）判定藥物敏感性，Ф≥20 mm為高度敏感，15mm≤Ф＜20mm為中度敏感，Ф＜15mm為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 副豬嗜血桿菌鑒定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，將接種的病料置于5%CO2環(huán)境下37℃培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，在TSA培養(yǎng)基上可見針尖大小、灰白色透明、光滑濕潤、邊緣整齊的菌落，染色鏡檢為兩極濃染的革蘭氏陰性小桿菌。對其進(jìn)行接觸酶試驗，結(jié)果呈陽性。初步鑒定為副豬嗜血桿菌。

待檢菌在有金黃葡萄球菌劃線的普通羊血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24 h后，呈現(xiàn)典型的有金黃葡萄球菌周圍待檢菌落生長良好且密集，而遠(yuǎn)處菌落生長較差，較稀疏，甚至不生長即“衛(wèi)星現(xiàn)象”，即越靠近金黃葡萄球菌的生長狀況越良好，遠(yuǎn)離金黃葡萄球菌的生長狀態(tài)較差甚至不生長。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

分離株對氟苯尼考、環(huán)丙沙星為高度敏感，對恩諾沙星、磺胺嘧啶、青霉素G、慶大霉素中度敏感，對氨芐西林不敏感，有很強(qiáng)的耐藥性（表1）。

表1 藏豬副豬嗜血桿菌病的病原藥敏試驗結(jié)果 mm

3 討論

在間接血凝抗體ELISA檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，有效提高針對性培養(yǎng)分離藏豬副豬嗜血桿菌的速率和準(zhǔn)確性，減少了PCR的操作鑒定環(huán)節(jié)。

拉薩-林芝公路沿線藏豬對恩諾沙星、磺胺嘧啶、青霉素G、慶大霉素中度敏感，對氨芐西林不敏感，有很強(qiáng)的耐藥性。農(nóng)牧民經(jīng)常盲目給發(fā)病豬投喂氨芐西林，致使副豬嗜血桿菌產(chǎn)生耐藥，在投喂氨芐西林看不到效果后，再給具有一定野性的藏豬注射青霉素G和慶大霉素，或換投恩諾沙星和磺胺嘧啶等，亂用與濫用抗生素。在拉薩-林芝公路沿線農(nóng)牧民散養(yǎng)藏豬沒有補(bǔ)飼豬飼料的習(xí)慣，加之當(dāng)?shù)孬F醫(yī)很少接觸到氟苯尼考，藏豬副豬嗜血桿菌對氟苯尼考高度敏感；在拉薩-林芝公路沿線獸用環(huán)丙沙星幾乎沒有，環(huán)丙沙星主要為價格較貴的人用藥，農(nóng)牧民舍不得投喂于藏豬，所以藏豬副豬嗜血桿菌對環(huán)丙沙星高度敏感。

對有條件的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)病藏豬，應(yīng)在確診的基礎(chǔ)上，與相關(guān)教學(xué)科研單位協(xié)作，通過藥敏試驗，有目的、有針對性地用藥，且用藥應(yīng)有足夠療程和劑量，盡量減少耐藥菌株產(chǎn)生[6-8]。

[1]Barbara E S,Jefery J Z,Sylvie D A.趙德明，張仲秋，沈建忠，譯.豬病學(xué)[M].第8版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：491-498.

[2]司振書，王桂英.副豬嗜血桿菌病研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（6）：179-182.

[3]Oliveira S,Pijoan C.Haemophilus parasuis:new trends on diagnosis,epidemiology and control[J].Veterinary Microbiology, 2004,99(1):1-12.

[4]唐建華，陳曉英，拉巴次旦，等.拉林公路沿線藏豬副豬嗜血桿菌血清抗體流行病學(xué)調(diào)查[J].養(yǎng)豬，2015（5）：105-106.

[5]石河子墾區(qū)副豬嗜血桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查研究 [D].石河子：石河子大學(xué)，2013.

[6]祝天龍，陸敘元，陳曉棟.嘉興市規(guī)模豬場副豬嗜血桿菌病的病原分離鑒定與防治技術(shù)研究[J].當(dāng)代畜牧，2013（27）：44-46.

[7]錢峰，樊俊榮，錢尉.副豬嗜血桿菌病的診斷及防治[J].畜牧與飼料科學(xué)，2016，37（5）：81-83.

[8]高艷.副豬嗜血桿菌病的流行特點及綜合防治措施[J].畜牧與飼料科學(xué)，2016，37（5）：85-86.

（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2017)04-0095-02

2017-06-04

王潤錦（1980-），男，四川蒼溪人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病防控技術(shù)服務(wù)指導(dǎo)工作.E-mail：46056328@qq.com通訊作者：馬金英（1971-），女，西藏拉薩人，副研究員，碩士，主要從事高原動物安全生產(chǎn)研究工作.E-mail：majinying0891@163.com