黃亞強，黃紅星，麥智鵬，黎衛(wèi)，鄭軼群，袁潤強

（中山大學附屬中山醫(yī)院 泌尿外科，廣東 中山 528403）

MicroRNA-224靶向CNNM1抑制前列腺癌血管生成的實驗研究*

黃亞強，黃紅星，麥智鵬，黎衛(wèi)，鄭軼群，袁潤強

（中山大學附屬中山醫(yī)院 泌尿外科，廣東 中山 528403）

目的研究microRNA-224（miR-224）對前列腺癌生化復發(fā)及血管生成的影響。方法生物信息學分析及熒光素酶報告實驗預測細胞周期調(diào)節(jié)蛋白1（CNNM1）受miR-224負性調(diào)控。Taylor前列腺癌數(shù)據(jù)庫分析、驗證CNNM1、miR-224的表達關(guān)系及其與前列腺癌生化復發(fā)的相關(guān)性。前列腺癌PC3細胞體外培養(yǎng)及動物體內(nèi)成瘤實驗研究CNNM1、miR-224表達對前列腺癌微血管生成標志物CD31的影響。結(jié)果CNNM1表達受miR-224靶向調(diào)節(jié)，前列腺癌組織中CNNM1與miR-224的表達呈負相關(guān)（P＜0.05）。miR-224與前列腺癌的生化復發(fā)呈負相關(guān)（P＜0.05），CNNM1與前列腺的生化復發(fā)呈正相關(guān)（P＜0.05）；在過表達miR-224的PC3細胞株內(nèi)，CNNM1和CD31的表達量下降；CNNM1過表達能促進CD31的生成。前列腺癌細胞裸鼠體內(nèi)成瘤組織免疫組織化學法染色提示，miR-224過表達能抑制前列腺癌組織內(nèi)微血管形成。結(jié)論miR-224通過靶向調(diào)控CNNM1表達，抑制前列腺癌微血管形成，控制前列腺癌生化復發(fā)。

前列腺癌；microRNA-224；細胞周期調(diào)節(jié)蛋白1；生化復發(fā)；血管生成

血管生成為腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì)，是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？寡苌莎煼槟[瘤治療，特別是晚期惡性腫瘤的治療提供一種有效的方法[1]。MicroRNA（miRNAs）的主要生物學功能是通過抑制翻譯起始和/或降解信使RNA的途徑，來調(diào)控編碼基因的表達而實現(xiàn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-224（miR-224）過表達能抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移，并促進細胞凋亡，起抑癌基因作用[3]。本研究旨在探索miR-224調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)節(jié)蛋白1（cyclin and CBS domain divalent metal cation transport mediator 1，CNNM1）抑制前列腺癌微血管形成的機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

PC3細胞（美國ATCC公司），改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（北京塞默飛世爾生物），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）（浙江天杭生物科技），過表達miRNA-224質(zhì)粒/過表達CNNM1質(zhì)粒（長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，haslet-7e），裸鼠（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），雙熒光報告分析系統(tǒng)（美國Promega公司），免疫組織化學法試劑盒PK-6100（美國Vector公司），Western blot試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司），CNNM1、CD31抗體購自美國Abcam公司。

1.2 Taylor數(shù)據(jù)庫篩選及靶基因預測

Taylor數(shù)據(jù)庫是一個公用的數(shù)據(jù)平臺，其中包含139例原發(fā)性前列腺癌組織的miRNAs、mRNA表達譜及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)[4]。在SPSS 17中采用Pearson相關(guān)性分析篩選Taylor數(shù)據(jù)庫中與miR-224呈負相關(guān)的基因（r＜-0.32，P＜0.05），再用 miRNAs靶基因預測軟件 Targetscan、PicTar、miRanda及 miRwalk 共同對miR-224下游靶基因進行預測，選4個預測軟件共有的交集靶基因進一步研究。

1.3 過表達miR-224的PC3細胞構(gòu)建及細胞保存、培養(yǎng)

用has-let-7e包裝質(zhì)粒混合液轉(zhuǎn)染miR-224/miR-NC到293TN細胞株，3 d后根據(jù)包裝的說明書用Lenti-Concentin病毒沉淀溶液（LV810A-1，美國SBI公司）提取收集病毒顆粒。然后用Trans Dux病毒轉(zhuǎn)染試劑（LV850A-1，美國SBI公司）轉(zhuǎn)染PC3細胞株。流式細胞儀分選miR-224過表達及空白對照細胞株并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和 Western blot檢測驗證。用10%二甲基亞砜+90%FBS懸浮PC3細胞，冷凍保存于液氮中。使用時，取出冷凍的PC3細胞，置于37℃溫水中致其融化，1000r/min離心5min，棄上清液，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，使其成對數(shù)生長時進行實驗。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

含有miR-224結(jié)合靶位點的野生型和突變型序列的CNNM1 3’UTR分別克隆到psi-CHECK2熒光素酶報告載體，3’UTR序列載體分別與miR-224模擬物（miR-224）或?qū)φ招蛄校╩iR-NC）共轉(zhuǎn)染到PC3細胞株中，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灉y定PC3細胞熒光素酶的活性以判斷miR-224對CNNM1 3’UTR的潛在結(jié)合位點的作用。

1.5 Western blot檢測

提取PC3細胞蛋白，灌膠上樣蛋白20μg/孔，濃縮膠電泳條件為80 V、30 min，分離膠電泳條件為90 V、90 min，轉(zhuǎn)膜條件為 120 V、90 min。一抗 4℃過夜，二抗孵育2 h。選擇合適的曝光底片，將底片進行高清掃描，通過Image J軟件進行灰度值的分析。

1.6 裸鼠成瘤實驗及免疫組織化學法染色

取過表達miR-224和對照組PC3細胞，分別注射到同裸鼠背部左右對稱部位的皮下，接種細胞數(shù)5×106個/側(cè)，共接種4只裸鼠。每4天測量1次腫瘤長度和寬度，并計算腫瘤體積（mm3）=寬2（mm2）×長（mm）/2。接種后第32天處死裸鼠獲取移植瘤組織，繪制腫瘤生長曲線圖。

裸鼠成瘤組織進行石蠟切片，常規(guī)脫蠟、抗原修復及內(nèi)源性過氧化物酶滅活，加一抗4℃孵育過夜。次日依次加入生物素化二抗、二氨基聯(lián)苯氨避光顯色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水及二甲苯透明，中性樹膠封片。染色結(jié)果判斷：顯微鏡下隨機選取10個視野，以微血管著色為基準，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；400倍顯微鏡下無微血管染色為0分，1～5條微血管著色為1分，6～10條微血管著色為2分，＞10條微血管著色為3分。2項結(jié)果相乘為染色總評分。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；相關(guān)性分析用Pearson法，生存率的比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織miR-224、CNNM1表達與疾病生化復發(fā)的相關(guān)性

從Talyor數(shù)據(jù)庫得到139例前列腺癌根治術(shù)患者的資料，其中133例患者有miR-224表達數(shù)據(jù)，采用Kaplan-Meier法分析miR-224、CNNM1與前列腺癌生化復發(fā)的相關(guān)性。miR-224高表達組的無生化復發(fā)生存率與低表達組比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.593，P=0.018），高表達組的無生化復發(fā)生存率高于低表達組。CNNM1高表達組的無生化復發(fā)生存率與低表達組比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.528，P=0.033），高表達組低于低表達組。見圖1。

2.2 miR-224的下游靶基因CNNM1

Pearson相關(guān)性分析提示，Taylor數(shù)據(jù)庫中與miR-224呈負相關(guān)的基因共39個，再經(jīng)軟件Targetscan、Pic Tar、miRanda及 miRwalk共同對 miR-224下游靶基因進行預測，結(jié)果顯示，CNNM1為miR-224的下游靶基因（r=-0.378，P=0.010）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-224過表達對CNNM1野生型和突變型3’UTR序列的熒光載體活性影響比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=12.926，P=0.007）。與對照組比較，miR-224過表達降低CNNM1野生型3’UTR區(qū)的熒光載體活性，而對CNNM1突變型3’UTR區(qū)的熒光載體活性無影響；在miR-224過表達的細胞中，與CNNM1突變型 3’UTR區(qū)相比，miR-224降低CNNM1野生型3’UTR區(qū)的熒光載體活性，表明miR-244能與CNNM1基因的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合，影響CNNM1基因的表達。見圖2。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線分析

圖2 miR-224與CNNM1的相關(guān)性及調(diào)控關(guān)系

2.3 miR-224通過CNNM1抑制前列腺癌細胞CD31的表達

前列腺癌PC3細胞株轉(zhuǎn)染miR-224，經(jīng)復蘇、培養(yǎng)，提取細胞miRNA。經(jīng)RT-PCR驗證miR-224過表達成功，提取細胞蛋白用Western-blot檢測CNNM1和CD31蛋白表達情況。結(jié)果提示，miR-224過表達與對照組的CNNM1表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.905，P=0.008）；miR-224 過表 達與對 照組CD31表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.658，P=0.009）。miR-224過表達的PC3細胞CNNM1和CD31表達量較對照組減少。見圖3。

為進一步明確前列腺癌細胞中CD31與CNNM1表達的關(guān)系，構(gòu)建過表達CNNM1的PC3細胞，并經(jīng)PCR驗證，提取細胞蛋白檢測CD31的變化，結(jié)果提示CNNM1表達增加能促進CD31的表達（t=3.303，P=0.030）。見圖 4。

2.4 miR-224抑制前列腺癌生長及腫瘤微血管形成

將miR-224過表達和對照組PC3細胞株注射到裸鼠皮下，復制異體移植瘤模型。miR-224組與對照組細胞注射到皮下 8、12、16、20、24、28 和 32 d 后，測量移植瘤的體積，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同生長時間點的移植瘤體積比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.302，P=0.003）；②miR-224 組與對照組在相同生長時間的移植瘤體積比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=12.620，P=0.004），miR-224組與對照組比較，在相同生長時間下其移植瘤的體積較小，miR-224能抑制腫瘤的生長；③miR-224組與對照組的移植瘤生長的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=26.347，P=0.002）。見附表和圖 5。

圖3 miR-224對CNNM1和CD31表達的影響

圖4 CNNM1對CD31表達的影響

附表 兩組不同時間的腫瘤生長情況 （n=4，cm3，±s）

附表 兩組不同時間的腫瘤生長情況 （n=4，cm3，±s）

組別 8 d 12 d 16 d 20 d 24 d 28 d 32 d miR-224 組 0.06±0.01 0.11±0.03 0.18±0.07 0.23±0.07 0.33±0.07 0.38±0.10 0.42±0.16對照組 0.12±0.02 0.21±0.06 0.31±0.07 0.46±0.07 0.54±0.09 0.63±0.12 0.76±0.19

圖5 PC3細胞裸鼠皮下移植瘤模型生長曲線圖

將裸鼠腫瘤組織石蠟切片，用CD31抗體進行免疫組織化學法染色以評估微血管的形成，結(jié)果提示，對照組腫瘤組織內(nèi)微血管數(shù)量為（5.65±1.36）條，過表達miR-224腫瘤組織內(nèi)微血管數(shù)量為（3.42±1.15）條，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.067，P=0.012），過表達miR-224腫瘤組織內(nèi)微血管數(shù)量減少。見圖6。

圖6 miR-224對前列腺癌細胞體內(nèi)成瘤標本血管形成的影響

3 討論

miRNAs對基因的調(diào)節(jié)方式復雜，1個microRNA能調(diào)節(jié)不同的基因，不同的microRNA能調(diào)節(jié)同個基因，這樣復雜的網(wǎng)絡構(gòu)成microRNAs對基因功能的精確調(diào)節(jié)。miR-224與腫瘤的關(guān)系存在腫瘤異質(zhì)性，即miR-224在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用。有報道稱，miR-224在肝癌中高表達，能促進肝癌細胞的增殖、遷徙及侵襲，另外在乳腺癌、結(jié)腸癌中也有類似作用[5-7]。在前列腺癌中，miR-224通過靶向負性調(diào)控CAMKK2，抑制前列腺癌細胞侵襲及增殖[8]。

本研究首先通過Taylor前列腺癌數(shù)據(jù)庫篩選，發(fā)現(xiàn)miR-224、CNNM1與前列腺癌的生化復發(fā)相關(guān)。再通過多種軟件共同預測提示，CNNM1是miR-224所調(diào)控的潛在下游靶基因，進一步分析發(fā)現(xiàn)CNNM1與miR-224呈負相關(guān)，miR-224降低攜帶CNNM1野生型3’UTR序列的熒光報告載體的活性，這符合miRNAs對下游基因的調(diào)節(jié)機制。CNNM1作為一種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，與人類腫瘤的關(guān)系尚不明確。有研究報道，在小鼠精原細胞中，CNNM1與腫瘤細胞分化有關(guān)，低表達的CNNM1能促發(fā)精原細胞的惡性分化[9]。FURUTA等[10]研究認為，CNNM1啟動子的甲基化與人類惡性黑色素瘤的形成有關(guān)。本實驗結(jié)果提示，在前列腺癌細胞株P(guān)C3中，miR-224過表達能使CNNM1和CD31表達下調(diào)，CNNM1過表達能促進CD31的生成。裸鼠成瘤免疫組織化學法染色進一步證實，過表達miR-224能抑制腫瘤組織內(nèi)微血管數(shù)量形成。CD31又稱為血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子，主要用于證明內(nèi)皮細胞組織的存在，是常用于評估腫瘤新生血管形成的標志物，CD31表達升高意味著腫瘤微血管生成增加[11]。微血管的形成能促進腫瘤細胞的局部遷徙和遠處轉(zhuǎn)移[12]。因此筆者推測，在前列腺癌中，miR-224與生化復發(fā)呈負相關(guān)可能與miR-224抑制前列腺癌微血管生成有關(guān)。

上世紀70年代，F(xiàn)OLKMAN[13]首次提出，腫瘤生長依賴于新血管生成，并逐漸使該領(lǐng)域成為腫瘤研究的熱點。新生血管使腫瘤能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，是促成腫瘤從無血管的緩慢生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段的關(guān)鍵；抗血管治療有望阻斷腫瘤血管的生成，從而最終達到抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用[14]。由于miRNAs功能的多樣性，人們對miRNAs在腫瘤血管生成方面的作用也進行廣泛研究，發(fā)現(xiàn)miR-494可以促進非小細胞肺癌的血管生成，miR-21可以通過蛋白激B/缺氧誘導因子1a/血管內(nèi)皮生長因子通路，誘導前列腺癌新生血管形成[15-16]?？梢妋iRNAs本身就是重要的腫瘤抗血管治療靶標。本研究結(jié)果提示，miR-224靶向CNNM1，抑制前列腺癌生化復發(fā)及微血管生成，為研究miRNAs與前列腺癌血管生成的關(guān)系提供更多理論依據(jù)。

綜上所述，本研究首次提出，miR-224靶向調(diào)控前列腺癌細胞CNNM1的表達，抑制腫瘤微血管的形成，減少前列腺癌生化復發(fā)。對miR-224-CNNM1軸的進一步研究能更深入了解前列腺癌進展的分子機制，并使miR-224成為前列腺癌治療的潛在靶標。

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（童穎丹 編輯）

miR-224 inhibits angiogenesis of prostate cancer by targeting cyclin protein M1*

Ya-qiang Huang,Hong-xing Huang,Zhi-peng Mai,Wei Li,Yi-qun Zheng,Run-qiang Yuan
(Department of Urology,Zhongshan Hospital of Sun Yat-sen University,Zhongshan,Guangdong 528403,China)

ObjectiveTo investigate the impacts of miR-224 on biochemical recurrence and angiogenesis of prostate cancer.MethodsBioinformatics analysis and luciferase reporter assay were performed to predict the gene that can be directly inhibited by miR-224.Taylor database was used for confirming the expressions of CNNM1 and miR-224,and their correlations with biochemical recurrence of prostate cancer.Finally,the impacts of CNNM1 and miR-224 on angiogenesis of prostate cancer were explored by PC3 cellin vitroandin vivo.ResultsCNNM1 was directly regulated by miR-224,and their expression levels were negatively correlated in prostate cancer tissue(r=-0.378,P＜0.05).miR-224 was negatively correlated to,while CNNM1 was positively correlated to biochemical recurrence of prostate cancer (P＜0.05).The expressions of CNNM1 and CD31 decreased in the PC3 cells overexpressing miR-224 (P＜0.05).However,CNNM1 enhanced the expression level of CD31 (P＜0.05).The immunochemical staining of the transplantation tumor in the nude mice displayed that miR-224 overexpression could suppress angiogenesis in the prostate cancer tissue.ConclusionsmiR-224 suppresses angiogenesis and biochemical recurrence of prostate cancer by targeting CNNM1.

prostate cancer;miR-224;CNNM1;biochemical recurrence;angiogenesis

R737.25

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.004

1005-8982（2017）17-0019-06

2017-02-06

中國博士后科學基金（No：2016M590842）；廣東省醫(yī)學科研基金（No：A2016052）；廣東省中山市科技計劃（No：2016B1028）

黃紅星，E-mail：hhxzs@21cn.com