石宇紅，彭瓊，任亞飛，許佳，李麗梅，李寶貞，莫漢有

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，廣西 桂林 541002）

基礎(chǔ)研究·論著

青藤堿對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜血管新生的影響*

石宇紅，彭瓊，任亞飛，許佳，李麗梅，李寶貞，莫漢有

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，廣西 桂林 541002）

目的觀察青藤堿對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠（CIA）低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及基質(zhì)金屬蛋白9（MMP-9）的影響，探討青藤堿對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）滑膜血管新生的作用機(jī)制。方法40只遠(yuǎn)交群大鼠，隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組，余30只大鼠采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑的方法復(fù)制關(guān)節(jié)炎模型。15 d后造模大鼠隨機(jī)分為模型組、雷公藤組、青藤堿組，每組10只。雷公藤組：雷公藤多甙片9.68 mg/（kg·d）灌胃給藥；青藤堿組：青藤堿片100 mg/（kg·d）灌胃給藥；模型組灌服等體積0.9%氯化鈉注射液。1次/d，共28 d。期間測(cè)量大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度。灌藥28 d后處死大鼠，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織HIF-1α水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清中VEGF、MMP-9水平。結(jié)果與模型組比較，青藤堿組和雷公藤組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度減輕（P＜0.05）；青藤堿組和雷公藤組滑膜組織中HIF-1α表達(dá)降低（P＜0.05）；青藤堿組和雷公藤組血清中VEGF、MMP-9表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論青藤堿可降低CIA踝關(guān)節(jié)腫脹，療效與雷公藤多甙相當(dāng)。其機(jī)制可能是通過下調(diào)HIF-1α的表達(dá)及VEGF、MMP-9水平，從而減少滑膜新生血管生成。

青藤堿；Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；低氧誘導(dǎo)因子1α；基質(zhì)金屬蛋白9

新生血管翳是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）關(guān)節(jié)破壞的關(guān)鍵。目前研究發(fā)現(xiàn)，血管新生與低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）[1]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[2-3]、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）[4]有關(guān)，其共同作用可影響新生血管的形成。

青藤堿是從青風(fēng)藤中提取的單體，其對(duì)RA、強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫性疾病有較好的治療作用。本研究通過復(fù)制Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠（collagen-induced arthritis rats，CIA）模型，探討青藤堿對(duì)模型大鼠HIF-1α、VEGF及MMP-9的影響和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級(jí)遠(yuǎn)交群（sprague dawley，SD）大鼠，雄性，40只，體重120～160 g。由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK桂2013-0001）。在桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑

青藤堿（正清風(fēng)痛寧片，湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：Z43020278），雷公藤多甙片（浙江得恩德制藥有限公司，批號(hào)：Z33020422），牛Ⅱ型膠原（美國(guó)Chondrex公司），不完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司），HIF-1α小鼠單克隆抗體（美國(guó)Thermo公司），羊抗鼠二抗（福州邁新生物工程有限公司），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（大連寶生生物工程有限公司），VEGF試劑盒（南京建成生物工程研究所），MMP-9試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

基因擴(kuò)增儀（德國(guó)Biometra公司），凝膠電泳結(jié)果圖像分析儀（上海培清JS-780），可調(diào)式微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司），光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司，IX71），病理組織切片機(jī)（德國(guó)LEICA RM公司，2025），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，5804R），微量臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thremo公司）。

1.4 動(dòng)物模型的復(fù)制及分組

健康雄性SD大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組，其余30只復(fù)制Ⅱ型CIA大鼠模型。取適量濃度為2 mg/ml牛Ⅱ型膠原溶液逐滴加入等容積的弗氏不完全佐劑中，牛Ⅱ型膠原終濃度調(diào)整為1 mg/ml。用勻漿器在冰浴中充分乳化至滴加水中不擴(kuò)散，取乳化后的混合物按200 μg/只，于尾根部皮下注射，7 d后按牛Ⅱ型膠原100 μg/只，尾根部皮下加強(qiáng)免疫1次。免疫15 d后，將大鼠分為模型組、雷公藤組、青藤堿組，每組10只。

1.5 給藥方法及樣本制備

分組后開始灌胃給藥，對(duì)照組正常條件下喂養(yǎng)，不做任何處理；模型組給予0.9%氯化鈉注射液100.00 mg/（kg·d）；雷公藤組給予雷公藤多甙片9.68 mg/（kg·d）；青藤堿組給予青藤堿片100.00 mg/（kg·d）。以上藥物均連續(xù)灌胃28 d。28 d后戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，2 500 r/min離心20 min，取血漿，分裝后置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。取腕關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)的滑膜組織于4%多聚甲醛中固定。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)量 第1次免疫前在大鼠后肢踝關(guān)節(jié)上方0.5 cm處進(jìn)行標(biāo)記，分別于免疫前及給藥完成后用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量踝關(guān)節(jié)排水體積，計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度。腫脹度=（Vt-Vo）/Vo×100%，Vo為造模前的容積，Vt為給藥完成后的容積。

1.6.2 滑膜病理學(xué)評(píng)分 留取血樣后處死大鼠，取腕關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)放入4%多聚甲醛固定16 h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脫鈣，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋切片、蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜增生、滑膜下炎癥程度及血管翳生成情況?；の⒀軝z測(cè)：每個(gè)標(biāo)本在100倍光鏡下隨機(jī)抽取5個(gè)視野做毛細(xì)血管計(jì)數(shù)，以5個(gè)視野計(jì)數(shù)的均值作為每個(gè)標(biāo)本的血管計(jì)量指標(biāo)。微血管密度結(jié)果判定：低倍鏡下找到病灶中微血管最密集（熱點(diǎn)）的3個(gè)區(qū)，高倍鏡（400倍）下計(jì)數(shù)該3個(gè)區(qū)的微血管數(shù)或微淋巴數(shù)，取3個(gè)高倍鏡下的微血管數(shù)平均值。

1.6.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HIF-1α的表達(dá) 滑膜組織切片先脫蠟、水化，0.01 mol/L、pH 6.0檸檬酸微波修復(fù)，3%雙氧水H2O2封閉，正常山羊血清封閉，加一抗，40℃過夜；加二抗，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，加二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液，沖洗、復(fù)染、封片、鏡檢。HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞為在胞質(zhì)或胞核中可見黃色或棕褐色陽(yáng)性產(chǎn)物的細(xì)胞。每張切片隨機(jī)檢測(cè)10個(gè)高倍鏡視野。①陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：陰性為0分，＜10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為 4分。②按陽(yáng)性著色程度評(píng)分：無(wú)著色、與背景色一致為0分，淺黃色略高于背景色為1分，棕黃色、明顯高于背景色為2分，棕褐色為3分。③兩者乘積判定陽(yáng)性結(jié)果。

1.6.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)VEGF 濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋，加入血漿標(biāo)本稀釋液1.0 ml至標(biāo)準(zhǔn)品中，待徹底溶解后，靜置15 min混勻（濃度為2 μg/L），然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。以生物素化抗體稀釋液稀釋生物素化抗體，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物。要求注入自動(dòng)洗板機(jī)的洗滌液為350 μl，注入與吸出間隔15～30 d，洗板4次。除空白孔外，分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100μl/孔）加入相應(yīng)孔后用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育90 min，洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗體工作液（100μl/孔），用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育60 min，洗板4次。除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液（100μl/孔），封住板孔，37℃孵箱孵育30 min，洗板4次。加入底物顯色劑100 μl/孔，37℃避光孵育15～20 min（視顏色深淺靈活掌握），加入終止液100μl/孔，混勻后即刻（5 min內(nèi)）測(cè)量450 nm處吸光度值。

1.6.5 ELISA法檢測(cè)MMP-9的表達(dá) 采用血漿樣品，肝素鋰抗凝。其余步驟同VEGF。經(jīng)稀釋后加至預(yù)經(jīng)單抗或明膠包被的反應(yīng)微孔，37℃溫育反應(yīng)2 h，洗滌5次后加入辣根過氧化物-親和素偶聯(lián)物，37℃、30 min；再洗滌 5 次后加入 100 μl/孔 3，4，5-三甲氧基苯甲醛底物液室溫反應(yīng)10～15 min，最后加入50 μl 1.8 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MMP-9表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較

造模后第15天除對(duì)照組外，其他3組大鼠踝、跖趾關(guān)節(jié)及趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度紅腫，用藥28 d后，對(duì)照組、模型組、雷公藤組、青藤堿組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度分別為（11.21±3.12）%、（67.46±13.72）%、（31.46±12.57）%和（38.51±13.86）%，各組關(guān)節(jié)腫脹度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.293，P=0.001）。模型組與對(duì)照組的關(guān)節(jié)腫脹度比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.311，P=0.000），青藤堿組、雷公藤組與模型組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.456和2.919，P=0.015和0.004），青藤堿組和雷公藤組關(guān)節(jié)腫脹度比模型組低，藥物干預(yù)作用明顯。

2.2 大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠滑膜細(xì)胞扁平形，排列整齊，有少量纖維及毛細(xì)血管，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，軟骨層表面光滑，無(wú)結(jié)構(gòu)破壞。模型組大鼠滑膜細(xì)胞層明顯增多，滑膜細(xì)胞水腫，排列紊亂，部分滑膜組織可見呈絨毛狀增生，炎癥細(xì)胞及纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，有較多毛細(xì)血管，關(guān)節(jié)軟骨粗糙，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有纖維素樣滲出。雷公藤組滑膜細(xì)胞排列尚整齊，纖維組織輕度增生，可見少量炎癥細(xì)胞，血管增生不明顯，關(guān)節(jié)軟骨表面基本光滑，關(guān)節(jié)腔纖維素樣滲出不多。青藤堿組滑膜細(xì)胞層數(shù)較模型組增多，達(dá)到5、6層，有少量炎癥細(xì)胞存在，較雷公藤組稍增多，關(guān)節(jié)軟骨組織有輕度破壞。各組各項(xiàng)病理學(xué)評(píng)分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組與對(duì)照組病理學(xué)評(píng)分（總分、滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管數(shù)）比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.321、9.425、8.923 和 9.425，均P=0.000），青藤堿組與模型組病理學(xué)評(píng)分（總分、滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管數(shù)）比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.162、2.131、2.836 和 2.126，P=0.041、0.042、0.021和0.045）。見表1和圖1。

2.3 青藤堿對(duì)Ⅱ型CIA大鼠滑膜HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，HIF-1α蛋白在正常關(guān)節(jié)組織中不表達(dá)或僅有微弱表達(dá)，而在低氧狀態(tài)下則在胞質(zhì)或胞核中可見黃色或棕褐色的陽(yáng)性產(chǎn)物。對(duì)照組基本沒有HIF-1α蛋白表達(dá)；模型組有HIF-1α陽(yáng)性物質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中高表達(dá)，呈深褐色，尤其是位于滑膜最外層細(xì)胞；而雷公藤組和青藤堿組HIF-lα輕度表達(dá)。采用半定量積分法進(jìn)行分析，對(duì)照組、模型組、雷公藤組、青藤堿組大鼠HIF-1α 蛋白表達(dá)量分別為（1.422±0.783）、（7.354±2.548）、（3.122±1.178）和（3.743±1.624），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.781，P=0.000）。模型組與對(duì)照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.345，P=0.000），青藤堿組、雷公藤組與模型組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.358和 2.615，P=0.024 和 0.011）。見圖 2。

表1 各組大鼠滑膜病理學(xué)評(píng)分比較 （n=10，分，±s）

表1 各組大鼠滑膜病理學(xué)評(píng)分比較 （n=10，分，±s）

注:?與模型組、對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 總分 滑膜增生 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn) 新生血管數(shù)對(duì)照組 0.093±0.035 0.021±0.008 0.031±0.009 0.023±0.002模型組 0.782±0.095 0.517±0.013 0.137±0.062 0.218±0.145青藤堿組 0.563±0.168?0.275±0.129?0.106±0.028?0.161±0.163?雷公藤組 0.457±0.211?0.246±0.137?0.095±0.031?0.147±0.153?F值 14.985 10.468 6.729 8.873P值 0.000 0.000 0.000 0.001

圖1 大鼠踝關(guān)節(jié)腔病理學(xué)改變 （HE×200）

圖2 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織HIF-1α的表達(dá) （鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法×200）

2.4 CIA大鼠外周血中VEGF和MMP-9的水平

各組外周血VEGF、MMP-9水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.563和38.956，均P=0.000）。模型組與對(duì)照組的VEGF、MMP-9水平比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.332和5.314，均P=0.000），青藤堿組與模型組的VEGF、MMP-9水平比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.033和5.821，P=0.040和 0.013）。見表 2。

表2 各組大鼠外周血中VEGF和MMP-9的表達(dá)比較（n=10，μg/L，±s）

表2 各組大鼠外周血中VEGF和MMP-9的表達(dá)比較（n=10，μg/L，±s）

注：?與模型組、對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 VEGF MMP-9對(duì)照組 28.6±5.4 16.2±4.8模型組 135.7±18.5 82.4±9.3雷公藤組 74.8±10.3?40.6±8.5?青藤堿組 68.2±11.3?42.5±10.1?F值 42.563 38.956P值 0.000 0.000

3 討論

RA是我國(guó)常見的自身免疫性疾病之一，嚴(yán)重者可導(dǎo)致人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘，嚴(yán)重影響患者的生活和生存質(zhì)量。目前其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確?；赗A的主要病理改變是在炎癥的刺激下，大量炎癥細(xì)胞增生、浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)滑膜充血、水腫、組織疏松，毛細(xì)血管通透性增高，纖維素及漿液滲出至關(guān)節(jié)腔內(nèi)，滑膜細(xì)胞合成包括腫瘤壞死因子及白細(xì)胞介素等多種細(xì)胞因子，促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞增殖和微血管新生，滑膜血管翳形成，繼而侵蝕軟骨與骨組織，造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能損害[5-7]。新生血管形成和細(xì)胞外基質(zhì)降解是RA病理過程的核心環(huán)節(jié)，控制新生血管形成和細(xì)胞外基質(zhì)降解成為控制RA關(guān)節(jié)軟骨侵蝕破壞的關(guān)鍵。VEGF是已知的最強(qiáng)刺激血管新生的因子之一，在血管新生中發(fā)揮核心調(diào)控作用[8-9]。在血管的發(fā)育過程中，HIF-1對(duì)血管新生也起重要作用，通過抑制HIF-1α的降解，可使VEGF表達(dá)增加，最終導(dǎo)致缺血組織的血管新生[10]。既往研究也發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠模型中滑膜組織有HIF-1α高表達(dá)，并與炎癥程度呈正相關(guān)[11]。在缺氧條件下RA患者滑膜細(xì)胞HIF-1α與VEGF表達(dá)增高密切相關(guān)，提示HIF-1α-VEGF信號(hào)途徑在類風(fēng)濕炎的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。MMP-9是一類可有效降解細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜成分的蛋白水解酶，同時(shí)通過釋放生長(zhǎng)因子、趨化因子及細(xì)胞因子等，參與人體許多生理及病理過程。在對(duì)腫瘤血管新生的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MMP-9可在卵巢上皮癌過度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的生成[12]。在對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究中也發(fā)現(xiàn)，在MMP-9的作用下可出現(xiàn)滑膜襯里細(xì)胞增生、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜下細(xì)胞增生及滑膜下層血管生成，導(dǎo)致增生的滑膜組織向軟骨面生長(zhǎng)，形成血管翳，從而出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞[13]。提示MMP-9在關(guān)節(jié)滑膜血管新生的過程中也發(fā)揮重要作用。

青風(fēng)藤在我國(guó)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的歷史悠久，青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的單體生物堿，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用，現(xiàn)已用于RA的治療。目前研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可通過下調(diào)T細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)，減少細(xì)胞對(duì)鐵離子的攝入，從而抑制T細(xì)胞的活化與增殖；還可減少白細(xì)胞介素6的產(chǎn)生，抑制B細(xì)胞的活化，從而抑制關(guān)節(jié)免疫炎癥和關(guān)節(jié)破壞作用[14]。其還可以通過抑制滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、致炎因子干擾素-γ及一氧化氮等，發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)痛的效果[15-17]；并且青藤堿可提高CIA大鼠外周血OPG水平，OPG/RANKL比值升高，提示其有骨保護(hù)作用[16]。但對(duì)于血管新生方面的研究，國(guó)內(nèi)研究較少。本研究初步討論青藤堿對(duì)HIF-1α、VEGF及MMP9的影響，為青藤堿多種藥理學(xué)的免疫研究提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)CIA大鼠模型給予雷公藤多甙和青藤堿治療后，發(fā)現(xiàn)青藤堿可以降低CIA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度，并且在光鏡下也看到其對(duì)滑膜血管新生有抑制作用，其作用與雷公藤多甙效果相當(dāng)。HIF-1α的表達(dá)水平提示其可降低HIF-1α在滑膜的表達(dá)，結(jié)合對(duì)外周血VEGF和MMP-9的檢測(cè)，顯示青藤堿可降低VEGF和MMP-9的表達(dá)，效果與雷公藤多甙相當(dāng)。因此筆者認(rèn)為，青藤堿的抗風(fēng)濕機(jī)制除前面所說的免疫抑制和抗炎鎮(zhèn)痛等作用外，還有可能通過影響HIF-1α、VEGF及MMP-9的表達(dá)，抑制血管新生，從而減少滑膜血管翳的生成，減少關(guān)節(jié)破壞。

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（童穎丹 編輯）

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投稿細(xì)則

Effect of Sinomenine on synovial angiogenesis in rats with collagen-induced arthritis*

Yu-hong Shi,Qiong Peng,Ya-fei Ren,Jia Xu,Li-mei Li,Bao-zhen Li,Han-you Mo
(Department of Rheumatology and Immunology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541002,China)

ObjectiveTo observe the effect of Sinomenine on the expression of hypoxia-inducible factor-1 α (HIF-1α),vascular endothelial growth factor (VEGF)and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9)in rats with typeⅡcollagen-induced arthritis(CIA),and to explore its therapeutic roles and mechanism.MethodsTotally 40 male SD rats were recruited,among which 10 were randomly selected as the normal control group.The CIA model was established in the rest 30 rats by subcutaneous injection of typeⅡ collagen of bovine emulsion in the tail root and induction of incomplete Freund's adjuvant.On day 15 primary immunization rats were randomly divided into 3 groups,i.e.model group,Tripterygium Glycosides(TG)group(at a daily dose of 9.68 mg/kg body weight),and Sinomenine(SIN)group(at a daily dose of 100 mg/kg body weight),10 in each group.The corresponding medication was given to the rats of each group by gastrogavage once daily for 28 days.An equal volume of sodium chloride injection was given to the rats in the normal control group and the model group by gastrogavage,once daily for 28 successive days.The swelling degree of the joints was measured.The rats were sacrificed after 28-day treatment.Plasma levels of VEGF and MMP-9 were measured with ELISA.The expression of HIF-1α in synovium was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group,the swelling degree of the joints was significantly alleviated in the TG group and the SIN group (P＜0.05),the HIF-1α expression obviously decreased in the synovium of theTG group and the SIN group(P＜0.05),the plasma levels of VEGF and MMP-9 were lower in the TG group and the SIN group (P＜0.05).ConclusionsSIN could markedly alleviate the swelling degree of joints in the CIA model rats.Its therapeutic efficacy is equal to that of TG.Its mechanism might be by down-regulating the HIF-1α expression in joints and the plasma levels of VEGF and MMP-9,thereby reducing synovial neovascularization.

Sinomenine;type Ⅱ collagen-induced arthritis;hypoxia-inducible factor-1α;vascular endothelial growth factor;matrix metalloproteinase-9

1.文稿力求文字精練、準(zhǔn)確、通順；文題簡(jiǎn)明、醒目，能反映出文章的主題；勿用不規(guī)范字。請(qǐng)作者仔細(xì)校對(duì)全文，并認(rèn)真復(fù)核數(shù)據(jù)。摘要應(yīng)與正文內(nèi)藥物劑量、病例數(shù)、百分比等數(shù)據(jù)一致。如有錯(cuò)誤，將降低審稿人和編輯對(duì)該文真實(shí)性的信任度，導(dǎo)致退稿。2.文題中不使用英文縮略語(yǔ)。摘要中一般也不使用英文縮略語(yǔ)，如因?yàn)樵撛~出現(xiàn)多次而需要使用時(shí)，應(yīng)于首次出現(xiàn)處先寫出中文全稱，然后括號(hào)內(nèi)注明英文縮略語(yǔ)（此處不需寫出英文全稱）。正文中首次使用英文縮略語(yǔ)時(shí)，也應(yīng)于首次出現(xiàn)處先寫出中文全稱，然后括號(hào)內(nèi)注明英文全稱及英文縮略語(yǔ)。此規(guī)則對(duì)已公知、公用的縮略語(yǔ)除外。3.單位介紹信原件，注明稿件非一稿多投。采用網(wǎng)上投稿方式時(shí)，請(qǐng)將該介紹信照片插入提交的論文Word文稿第一頁(yè)。4.所有欄目投稿的中英文論文題目、作者姓名及作者單位需齊全（每位作者只標(biāo)注一個(gè)主要單位，其余的可以作者簡(jiǎn)介方式在首頁(yè)左下角注明，標(biāo)注通信作者的必須留下通信作者本人的電話或電子郵箱，以便核實(shí)）。5.欄目對(duì)中英文摘要的要求：基礎(chǔ)研究·論著、臨床研究·論著、新進(jìn)展研究·論著需中英文摘要齊全，并按目的、方法、結(jié)果、結(jié)論四要素書寫，200～500個(gè)字。綜述需中英文摘要齊全，不需按四要素書寫。臨床報(bào)道和學(xué)術(shù)報(bào)告只需中文摘要，病例報(bào)告無(wú)需中英文摘要。6.所有欄目需附關(guān)鍵詞3～5個(gè)，其中臨床報(bào)道、學(xué)術(shù)報(bào)告和病例報(bào)告只需中文關(guān)鍵詞，其余欄目需中英文關(guān)鍵詞齊全。7.照片、圖片（黑白原始照片必須清晰，大小5 cm×7 cm），須在文章內(nèi)標(biāo)明其位置，并附標(biāo)題，顯微鏡下照片應(yīng)標(biāo)明放大倍數(shù)，圖背面標(biāo)明作者姓名、文章編號(hào)、圖序及照片方向（上、下）。8.所有欄目參考文獻(xiàn)須引用10條以上，以近5年文獻(xiàn)為主。引用期刊的格式為：作者.文題.刊名，年，卷（期）：起止頁(yè)碼.；引用書籍的格式為：著者.書名.版次.出版地：出版社，年份：起止頁(yè)碼.；每條參考文獻(xiàn)應(yīng)列出作者姓名，如超過3名者，則在3名作者后寫等。中文格式：解勤之,陳方平,蹇在伏,等.紅細(xì)胞收縮：血小板無(wú)力癥的可能代償機(jī)制[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程,1998,8(11):3-5.。英文格式：SZEMAN B,NAGY G.Changes in cognitive function in patient with diabetes mellitus[J].Orv Hetil,2012,153(9):323-329.9.綜述第一作者須有副高以上職稱證明（參考文獻(xiàn)35條以上）。10.凡國(guó)家、省部級(jí)自然科學(xué)基金、博士基金、863計(jì)劃及國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目的論文，請(qǐng)注明基金名稱及編號(hào)并附相關(guān)項(xiàng)目批準(zhǔn)文件或任務(wù)書復(fù)印件，可優(yōu)先發(fā)表。項(xiàng)目主要負(fù)責(zé)人為通信作者。采用網(wǎng)上投稿方式時(shí)，請(qǐng)將相關(guān)證明材料的照片插入提交的論文Word文稿最后一頁(yè)。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.001

1005-8982（2017）17-0001-06

2016-07-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81460257）；廣西中醫(yī)藥管理局課題（No：gzzc1238）；廣西省桂林市攻關(guān)課題（No：20140120-1-2）