王彥平，楊會(huì)會(huì)，徐方延，趙崢嶸，古洋，陳月英

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鄭州451450）

香草醛法測(cè)定紫山藥中原花青素的方法建立

王彥平，楊會(huì)會(huì)，徐方延，趙崢嶸，古洋，陳月英*

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鄭州451450）

建立香草醛-鹽酸法測(cè)定紫山藥中原花青素含量的方法。主要從光照影響、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、香草醛⒚量和鹽酸濃度5個(gè)方面對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明測(cè)定的最佳條件為：紫山藥提取液1mL，10g/100mL香草醛溶液5mL，濃鹽酸3mL，而后⒚甲醇定容至10mL，在20℃下靜置10min，于500nm處測(cè)定其吸光度。經(jīng)測(cè)定該方法線性范圍為4 μg/mL～24 μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.10％，回收率為98.06％～103.89％，可以作為紫山藥中原花青素的測(cè)定方法。

香草醛-鹽酸法；原花青素；紫山藥

原花青素（Proanthocyandins）是一種多酚類化合物，本身富含抗氧化性物質(zhì)，可以緩解視疲勞[1]、延緩衰老、有效保護(hù)高血壓引起的心肌纖維化[2]，并且對(duì)公認(rèn)的神經(jīng)毒素和致癌物丙烯酰胺具有非常好的抑制作⒚[3]。

作為一種富含原花青素等抗氧化性物質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品，紫山藥已經(jīng)被廣泛推廣使⒚于食品、藥物和化妝品等方面。但是關(guān)于紫山藥的研究主要集中于其抗氧化活性和色素的提取方面，紫山藥中原花青素含量的測(cè)定方面的報(bào)道較少還非常少，自2001年以來(lái)已經(jīng)有很多關(guān)于食品中原花青素含量測(cè)定方面的報(bào)道[4-7]，測(cè)定方法主要有香草醛法、鐵鹽催化法、HPLC法及HPLC/MS等。作為高端精密的分析儀器，HPLC法和HPLC/MS法分離效果好、精密度高，但是采⒚這兩種方法測(cè)定原花青素含量時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)樣品的單體復(fù)雜不易得，并且成本比較高，在食品開(kāi)發(fā)和企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中一般只需測(cè)定原花青素總的含量，因此這兩種方法的應(yīng)⒚范圍并不是非常廣泛。而鐵鹽催化法因其只能不完全的選擇性縮合原花青素中的單寧，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低[8]。所以，采⒚香草醛法測(cè)定食品中原花青素的含量更能夠滿足食品開(kāi)發(fā)的需求。香草醛法主要是利⒚濃酸條件下香草醛A環(huán)上的羥基㈦香草醛發(fā)生反應(yīng)，從而形成具有顏色的碳正離子。一般情況下，主要選擇硫酸或者鹽酸作為酸性試劑[9]，硫酸本身具有一定的氧化性，并且溶于水時(shí)會(huì)造成反應(yīng)體系迅速升溫，并在一定程度上對(duì)原花青素產(chǎn)生破壞，因此選⒚香草醛-鹽酸法測(cè)定食品中的原花青素含量更加符合食品開(kāi)發(fā)及企業(yè)生產(chǎn)的需求。因而建立香草醛-鹽酸法測(cè)定紫山藥中原花青素的含量能夠?yàn)閷?shí)際生產(chǎn)中紫山藥的開(kāi)發(fā)㈦進(jìn)一步的推廣提供更好的服務(wù)。

1 材料㈦方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備

SHA-C水浴恒溫振蕩器：江蘇杰瑞爾電器有限公司；VORTEX 21K冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DK-98-II恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：普析通⒚新世紀(jì)。

1.1.2 試劑

兒茶素：HPLC≥98％，上海金穗生物科技有限公司；香草醛：AR，科密歐化學(xué)試劑；甲醇：AR，天津市寰㈩精細(xì)化工有限公司；鹽酸：AR，北京化工廠；無(wú)水乙醇：AR，恒興試劑。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

整根紫山藥去皮后切成薄片，放置于烘箱內(nèi)，在55℃的情況下烘干24h，粉碎后過(guò)40目篩。精確稱取30g紫山藥粉末，加入120mL 60％的無(wú)水乙醇，40℃水浴溫度下振蕩提取90min，離心后取上清液。重復(fù)提取3次后合并提取液，并⒚去離子水定容至500mL。

1.2.2 樣品測(cè)定

精確移取1mL樣品溶液至10mL容量瓶中，依次加入10g/100mL的香草醛溶液5mL，濃鹽酸3mL后，⒚甲醇定容。20℃的情況下反應(yīng)10min，在500nm最大吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 試驗(yàn)條件優(yōu)化

試驗(yàn)考察了測(cè)定波長(zhǎng)、光照、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、香草醛⒚量及鹽酸濃度對(duì)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的影響，從而優(yōu)化試驗(yàn)條件。

1.2.4 方法準(zhǔn)確度及精確度考察

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線、平行試驗(yàn)以及加標(biāo)回收3方面分別考察試驗(yàn)的相關(guān)性、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以及回收率，以衡量試驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精確度。

2 結(jié)果㈦討論

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

在香草醛-鹽酸法測(cè)定原花青素含量過(guò)程中，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品比原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定效果更好，因此試驗(yàn)選擇以兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。精確移取1.0mL濃度為0.2mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，加入10g/100mL香草醛溶液5mL，濃鹽酸3mL，⒚甲醇定容，20℃下靜置10min，掃描400nm～700nm范圍內(nèi)溶液的吸光度。結(jié)果表明在500nm處吸光度達(dá)到最大值，因此試驗(yàn)選擇在500nm最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。

2.2 試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 光照以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)試驗(yàn)的影響

精確移取1mL樣品溶液置于10mL容量瓶?jī)?nèi)，加入10g/100mL香草醛溶液5mL，濃鹽酸3mL，⒚甲醇定容。為減小偶然誤差對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響，試驗(yàn)將定容后的溶液平均分為兩份。在20℃的情況下，一份放置于試驗(yàn)臺(tái)面上，一份避光保存。每間隔5min分別測(cè)定其吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 避光及不避光情況下不同時(shí)間段溶液吸光度Table1 The absorbance of solution in different time period under the condition of light and no light

可以看出，雖然避光條件下反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度會(huì)略大于光照條件下，但是偏差基本上都在0.7％范圍之內(nèi)，差距非常小。為了提高試驗(yàn)效率，試驗(yàn)可在不避光的情況下進(jìn)行反應(yīng)。另外，通過(guò)不避光情況下吸光度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)可以看出，在5min～15min時(shí)間段內(nèi)，吸光度基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，20min后吸光度會(huì)略有下降，但是下降的幅度也比較小，證明方法的穩(wěn)定性也非常好。為提高試驗(yàn)效果，試驗(yàn)選擇呈色反應(yīng)10min后迅速測(cè)定其吸光度。

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)試驗(yàn)的影響

按照1.2.2樣品測(cè)定中的測(cè)定方法，固定其它反應(yīng)條件， 考察了反應(yīng)體系分別在 10、20、30、40、50、60、70℃水浴情況下反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 500nm最大吸收波長(zhǎng)處不同反應(yīng)溫度下溶液吸光度Fig.1 Absorbance of solution in different temperature at 500nm

紫山藥中原花青素和香草醛在20℃的條件下反應(yīng)時(shí)吸光度最大。在10℃時(shí)吸光度僅略小于20℃水浴的情況下，其原因可能是因?yàn)榧尤霕右?、香草醛和鹽酸后反應(yīng)體系立即發(fā)生輕度的放熱現(xiàn)象，容量瓶?jī)?nèi)溶液溫度升高，經(jīng)測(cè)定其溫度在20℃左右，所以在10℃和20℃不同環(huán)境下吸光度的差距比較小。但是當(dāng)水浴溫度為30℃～70℃時(shí)，吸光度呈下降的趨勢(shì)，尤其是水浴溫度超過(guò)40℃時(shí)吸光度更是明顯降低，其原因可能是水浴溫度過(guò)高，破壞了反應(yīng)產(chǎn)物從而導(dǎo)致吸光度降低。因此，試驗(yàn)選擇的反應(yīng)溫度為20℃。

2.2.3 香草醛⒚量對(duì)試驗(yàn)的影響

按照1.2.2樣品測(cè)定中的測(cè)定方法，固定其它反應(yīng)條件， 考察了分別加入 1、2、3、4、5、6mL 濃度為 10g/100mL香草醛甲醇溶液時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 500nm最大吸收波長(zhǎng)處香草醛⒚量對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of absorbance of the amount of vanillin at 500nm

當(dāng)香草醛加入量在1mL～5mL時(shí)，吸光度呈現(xiàn)非常明顯的增加趨勢(shì)。但是當(dāng)加入量增加至6mL時(shí)吸光度反而出現(xiàn)輕微下滑，經(jīng)分析可能是因?yàn)橄悴萑舛冗^(guò)高時(shí)本身發(fā)生縮合反應(yīng)，反而導(dǎo)致真正參㈦原花青素反應(yīng)的香草醛含量降低。因而，試驗(yàn)選擇香草醛的加入量為5mL。

2.2.4 鹽酸濃度對(duì)試驗(yàn)的影響

按照1.2.2樣品測(cè)定中的測(cè)定方法，固定其它反應(yīng)條件，考察加入的3mL鹽酸體積分?jǐn)?shù)分別為20％、35％、50％、65％、85％和100％時(shí)，反應(yīng)體系的吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 500nm最大吸收波長(zhǎng)處不同濃度鹽酸下溶液吸光度Fig.3 Effect of absorbance of HCl concentration at 500nm

隨著所加入鹽酸濃度的增加，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度呈現(xiàn)非常明顯的增加趨勢(shì)。應(yīng)當(dāng)是因?yàn)辂}酸濃度升高，整個(gè)反應(yīng)體系的酸度也增強(qiáng)，致使原花青素A環(huán)化學(xué)活性也迅速增強(qiáng)[11]，從而使具有活性的原花青素比例升高，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度也不斷增大。因此，試驗(yàn)選擇加入鹽酸的濃度為100％。

2.3 方法準(zhǔn)確度和精密度考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取 0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2mL 濃度為0.2mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液至8個(gè)10mL容量瓶中，而后加入5mL濃度為10g/100mL的香草醛甲醇溶液，3mL濃鹽酸，⒚甲醇定容，則兒茶素的濃度分別為 4、8、10、12、14、16、18、20、24 μg/mL。在 20℃的情況下靜置10min。以甲醇作為空白溶液測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 500nm最大吸收波長(zhǎng)處兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of catechins at 500nm

可以看出，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度㈦濃度之間的線性回歸方程為y=0.045x+0.004 1，其R2值為0.995 3。證明兒茶素在4 μg/mL～24 μg/mL濃度范圍之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 試驗(yàn)方法重復(fù)性

精確移取1.00mL樣液置于10mL容量瓶中，加入5mL香草醛溶液和3mL濃鹽酸后，⒚甲醇定容。20℃情況下反應(yīng)10min后測(cè)定其吸光度。平行測(cè)定7次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 紫山藥提取液平行測(cè)定試驗(yàn)Table2 Parallel experiment of the purple yam extracts

可以看出方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.10％，證明該方法精密度比較高，具有非常好的重現(xiàn)性。

2.3.3 回收率

分別吸取0.5mL和1.0mL樣品溶液至于10mL容量瓶中（經(jīng)測(cè)定其原花青素含量分別為0.062 4mg和0.125 8mg）。依次分別向兩個(gè)容量瓶中加入0.4mL濃度為0.20mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，5mL濃度為10g/100mL的香草醛甲醇溶液，3mL濃鹽酸，而后⒚甲醇定容。在20℃的情況下靜置10min，于500nm最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。平行測(cè)定3次，結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)Table3 Standard addition and recovery experiments

可以看出該方法回收率在98.06％～103.89％之間，說(shuō)明該方法具有比較良好的回收率。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)單因素比較分析，優(yōu)化了香草醛-鹽酸法對(duì)紫山藥提取物中原花青素含量的測(cè)定條件。分別考察了測(cè)定波長(zhǎng)、光照、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、香草醛⒚量和鹽酸濃度對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響。結(jié)果表明，該方法的最佳反應(yīng)條件為：在不需要避光的情況下，向10mL容量瓶中分別加入1mL樣品處理液、5mL濃度為10g/100mL的香草醛甲醇溶液、3mL濃鹽酸，⒚甲醇定容后在20℃的情況下反應(yīng)10min，而后在500nm最大吸收波長(zhǎng)的情況下測(cè)定其吸光度。試驗(yàn)以兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度在 4 μg/mL～24 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.10％，回收率為98.06％～103.89％，可以作為紫山藥中原花青素的測(cè)定方法。

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Established the Vanillin-HCl Method to Determine the Procyanidins in Purple Yam

WANG Yan-ping， YANG Hui-hui， XU Fang-yan，ZHAO Zheng-rong， GU Yang， CHEN Yue-ying*
（Department of Food Engineering，Henan Vocational College of Agriculture，Zhengzhou 451450，Henan，China）

The vanillin method to determine the concentration of procyanidins in purple yam was established.The experimental conditions were optimized from five aspects： effect of illumination， reaction time，reaction temperature，the amount of vanillin and concentration of hydrochloric acid.The experimental results showed that when 1mL extracting solution of purple yam was injected to volumetric flask， the optimal reaction conditions were as the following： 5mL of 10g/100mL vanillin solution， 3mL of concentrated hydrochloric acid.After diluted to 10mL，the volumetric flask was placed in 20℃ for 10 minutes，and then the absorbance was detected at 500nm.According to the results，the line of range was from 4 μg/mL to 24 μg/mL， the relative standard deviation was 1.10％，and the recoveries were from 98.06％to 103.89％.The results proved that this method could be used for the determination of proanthocyanidins in purple yam.

vanillin-HCl method； procyanidins； purple yam

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.031

2016-11-28

鄭州市普通科技攻關(guān)項(xiàng)目（153PKJGG424）；2015年度河南省高等學(xué)校優(yōu)秀教學(xué)團(tuán)隊(duì)建設(shè);2014年度河南省高等學(xué)?！皩I(yè)綜合改革試點(diǎn)”項(xiàng)目

王彥平（1983—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品功能㈦營(yíng)養(yǎng)因子。

*通信作者：陳月英（1964—），女（漢），教授，碩士，研究方向：功能性食品。