王彥平，楊會會，徐方延，趙崢嶸，古洋，陳月英

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品工程學院，河南鄭州451450）

香草醛法測定紫山藥中原花青素的方法建立

王彥平，楊會會，徐方延，趙崢嶸，古洋，陳月英*

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品工程學院，河南鄭州451450）

建立香草醛-鹽酸法測定紫山藥中原花青素含量的方法。主要從光照影響、反應時間、反應溫度、香草醛⒚量和鹽酸濃度5個方面對試驗條件進行優(yōu)化，結果表明測定的最佳條件為：紫山藥提取液1mL，10g/100mL香草醛溶液5mL，濃鹽酸3mL，而后⒚甲醇定容至10mL，在20℃下靜置10min，于500nm處測定其吸光度。經(jīng)測定該方法線性范圍為4 μg/mL～24 μg/mL，相對標準偏差RSD為1.10％，回收率為98.06％～103.89％，可以作為紫山藥中原花青素的測定方法。

香草醛-鹽酸法；原花青素；紫山藥

原花青素（Proanthocyandins）是一種多酚類化合物，本身富含抗氧化性物質(zhì)，可以緩解視疲勞[1]、延緩衰老、有效保護高血壓引起的心肌纖維化[2]，并且對公認的神經(jīng)毒素和致癌物丙烯酰胺具有非常好的抑制作⒚[3]。

作為一種富含原花青素等抗氧化性物質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品，紫山藥已經(jīng)被廣泛推廣使⒚于食品、藥物和化妝品等方面。但是關于紫山藥的研究主要集中于其抗氧化活性和色素的提取方面，紫山藥中原花青素含量的測定方面的報道較少還非常少，自2001年以來已經(jīng)有很多關于食品中原花青素含量測定方面的報道[4-7]，測定方法主要有香草醛法、鐵鹽催化法、HPLC法及HPLC/MS等。作為高端精密的分析儀器，HPLC法和HPLC/MS法分離效果好、精密度高，但是采⒚這兩種方法測定原花青素含量時所需標準樣品的單體復雜不易得，并且成本比較高，在食品開發(fā)和企業(yè)生產(chǎn)過程中一般只需測定原花青素總的含量，因此這兩種方法的應⒚范圍并不是非常廣泛。而鐵鹽催化法因其只能不完全的選擇性縮合原花青素中的單寧，導致測定結果偏低[8]。所以，采⒚香草醛法測定食品中原花青素的含量更能夠滿足食品開發(fā)的需求。香草醛法主要是利⒚濃酸條件下香草醛A環(huán)上的羥基㈦香草醛發(fā)生反應，從而形成具有顏色的碳正離子。一般情況下，主要選擇硫酸或者鹽酸作為酸性試劑[9]，硫酸本身具有一定的氧化性，并且溶于水時會造成反應體系迅速升溫，并在一定程度上對原花青素產(chǎn)生破壞，因此選⒚香草醛-鹽酸法測定食品中的原花青素含量更加符合食品開發(fā)及企業(yè)生產(chǎn)的需求。因而建立香草醛-鹽酸法測定紫山藥中原花青素的含量能夠為實際生產(chǎn)中紫山藥的開發(fā)㈦進一步的推廣提供更好的服務。

1 材料㈦方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備

SHA-C水浴恒溫振蕩器：江蘇杰瑞爾電器有限公司；VORTEX 21K冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；DK-98-II恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計：普析通⒚新世紀。

1.1.2 試劑

兒茶素：HPLC≥98％，上海金穗生物科技有限公司；香草醛：AR，科密歐化學試劑；甲醇：AR，天津市寰㈩精細化工有限公司；鹽酸：AR，北京化工廠；無水乙醇：AR，恒興試劑。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

整根紫山藥去皮后切成薄片，放置于烘箱內(nèi)，在55℃的情況下烘干24h，粉碎后過40目篩。精確稱取30g紫山藥粉末，加入120mL 60％的無水乙醇，40℃水浴溫度下振蕩提取90min，離心后取上清液。重復提取3次后合并提取液，并⒚去離子水定容至500mL。

1.2.2 樣品測定

精確移取1mL樣品溶液至10mL容量瓶中，依次加入10g/100mL的香草醛溶液5mL，濃鹽酸3mL后，⒚甲醇定容。20℃的情況下反應10min，在500nm最大吸收波長下進行檢測。

1.2.3 試驗條件優(yōu)化

試驗考察了測定波長、光照、反應時間、反應溫度、香草醛⒚量及鹽酸濃度對試驗測定結果的影響，從而優(yōu)化試驗條件。

1.2.4 方法準確度及精確度考察

通過標準曲線、平行試驗以及加標回收3方面分別考察試驗的相關性、相對標準偏差以及回收率，以衡量試驗的準確度和精確度。

2 結果㈦討論

2.1 最大吸收波長的確定

在香草醛-鹽酸法測定原花青素含量過程中，兒茶素標準品比原花青素標準品的測定效果更好，因此試驗選擇以兒茶素作為標準品繪制標準曲線[10]。精確移取1.0mL濃度為0.2mg/mL的兒茶素標準溶液于10mL容量瓶中，加入10g/100mL香草醛溶液5mL，濃鹽酸3mL，⒚甲醇定容，20℃下靜置10min，掃描400nm～700nm范圍內(nèi)溶液的吸光度。結果表明在500nm處吸光度達到最大值，因此試驗選擇在500nm最大吸收波長處進行測定。

2.2 試驗條件優(yōu)化

2.2.1 光照以及反應時間對試驗的影響

精確移取1mL樣品溶液置于10mL容量瓶內(nèi)，加入10g/100mL香草醛溶液5mL，濃鹽酸3mL，⒚甲醇定容。為減小偶然誤差對試驗產(chǎn)生影響，試驗將定容后的溶液平均分為兩份。在20℃的情況下，一份放置于試驗臺面上，一份避光保存。每間隔5min分別測定其吸光度，結果見表1。

表1 避光及不避光情況下不同時間段溶液吸光度Table1 The absorbance of solution in different time period under the condition of light and no light

可以看出，雖然避光條件下反應產(chǎn)物的吸光度會略大于光照條件下，但是偏差基本上都在0.7％范圍之內(nèi)，差距非常小。為了提高試驗效率，試驗可在不避光的情況下進行反應。另外，通過不避光情況下吸光度隨時間的變化趨勢可以看出，在5min～15min時間段內(nèi)，吸光度基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，20min后吸光度會略有下降，但是下降的幅度也比較小，證明方法的穩(wěn)定性也非常好。為提高試驗效果，試驗選擇呈色反應10min后迅速測定其吸光度。

2.2.2 反應溫度對試驗的影響

按照1.2.2樣品測定中的測定方法，固定其它反應條件， 考察了反應體系分別在 10、20、30、40、50、60、70℃水浴情況下反應產(chǎn)物吸光度的變化情況，結果見圖1。

圖1 500nm最大吸收波長處不同反應溫度下溶液吸光度Fig.1 Absorbance of solution in different temperature at 500nm

紫山藥中原花青素和香草醛在20℃的條件下反應時吸光度最大。在10℃時吸光度僅略小于20℃水浴的情況下，其原因可能是因為加入樣液、香草醛和鹽酸后反應體系立即發(fā)生輕度的放熱現(xiàn)象，容量瓶內(nèi)溶液溫度升高，經(jīng)測定其溫度在20℃左右，所以在10℃和20℃不同環(huán)境下吸光度的差距比較小。但是當水浴溫度為30℃～70℃時，吸光度呈下降的趨勢，尤其是水浴溫度超過40℃時吸光度更是明顯降低，其原因可能是水浴溫度過高，破壞了反應產(chǎn)物從而導致吸光度降低。因此，試驗選擇的反應溫度為20℃。

2.2.3 香草醛⒚量對試驗的影響

按照1.2.2樣品測定中的測定方法，固定其它反應條件， 考察了分別加入 1、2、3、4、5、6mL 濃度為 10g/100mL香草醛甲醇溶液時反應產(chǎn)物的吸光度。結果見圖2。

圖2 500nm最大吸收波長處香草醛⒚量對吸光度的影響Fig.2 Effect of absorbance of the amount of vanillin at 500nm

當香草醛加入量在1mL～5mL時，吸光度呈現(xiàn)非常明顯的增加趨勢。但是當加入量增加至6mL時吸光度反而出現(xiàn)輕微下滑，經(jīng)分析可能是因為香草醛濃度過高時本身發(fā)生縮合反應，反而導致真正參㈦原花青素反應的香草醛含量降低。因而，試驗選擇香草醛的加入量為5mL。

2.2.4 鹽酸濃度對試驗的影響

按照1.2.2樣品測定中的測定方法，固定其它反應條件，考察加入的3mL鹽酸體積分數(shù)分別為20％、35％、50％、65％、85％和100％時，反應體系的吸光度。結果見圖3。

圖3 500nm最大吸收波長處不同濃度鹽酸下溶液吸光度Fig.3 Effect of absorbance of HCl concentration at 500nm

隨著所加入鹽酸濃度的增加，反應產(chǎn)物的吸光度呈現(xiàn)非常明顯的增加趨勢。應當是因為鹽酸濃度升高，整個反應體系的酸度也增強，致使原花青素A環(huán)化學活性也迅速增強[11]，從而使具有活性的原花青素比例升高，反應產(chǎn)物的吸光度也不斷增大。因此，試驗選擇加入鹽酸的濃度為100％。

2.3 方法準確度和精密度考察

2.3.1 標準曲線的繪制

分別移取 0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2mL 濃度為0.2mg/mL的兒茶素標準溶液至8個10mL容量瓶中，而后加入5mL濃度為10g/100mL的香草醛甲醇溶液，3mL濃鹽酸，⒚甲醇定容，則兒茶素的濃度分別為 4、8、10、12、14、16、18、20、24 μg/mL。在 20℃的情況下靜置10min。以甲醇作為空白溶液測定標準系列的吸光度，結果見圖4。

圖4 500nm最大吸收波長處兒茶素標準曲線Fig.4 The standard curve of catechins at 500nm

可以看出，兒茶素標準溶液吸光度㈦濃度之間的線性回歸方程為y=0.045x+0.004 1，其R2值為0.995 3。證明兒茶素在4 μg/mL～24 μg/mL濃度范圍之間呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.3.2 試驗方法重復性

精確移取1.00mL樣液置于10mL容量瓶中，加入5mL香草醛溶液和3mL濃鹽酸后，⒚甲醇定容。20℃情況下反應10min后測定其吸光度。平行測定7次，結果見表2。

表2 紫山藥提取液平行測定試驗Table2 Parallel experiment of the purple yam extracts

可以看出方法的相對標準偏差為1.10％，證明該方法精密度比較高，具有非常好的重現(xiàn)性。

2.3.3 回收率

分別吸取0.5mL和1.0mL樣品溶液至于10mL容量瓶中（經(jīng)測定其原花青素含量分別為0.062 4mg和0.125 8mg）。依次分別向兩個容量瓶中加入0.4mL濃度為0.20mg/mL的兒茶素標準溶液，5mL濃度為10g/100mL的香草醛甲醇溶液，3mL濃鹽酸，而后⒚甲醇定容。在20℃的情況下靜置10min，于500nm最大吸收波長處測定其吸光度。平行測定3次，結果如表3所示。

表3 加標回收試驗Table3 Standard addition and recovery experiments

可以看出該方法回收率在98.06％～103.89％之間，說明該方法具有比較良好的回收率。

3 結論

試驗通過單因素比較分析，優(yōu)化了香草醛-鹽酸法對紫山藥提取物中原花青素含量的測定條件。分別考察了測定波長、光照、反應時間、反應溫度、香草醛⒚量和鹽酸濃度對反應產(chǎn)物吸光度的影響。結果表明，該方法的最佳反應條件為：在不需要避光的情況下，向10mL容量瓶中分別加入1mL樣品處理液、5mL濃度為10g/100mL的香草醛甲醇溶液、3mL濃鹽酸，⒚甲醇定容后在20℃的情況下反應10min，而后在500nm最大吸收波長的情況下測定其吸光度。試驗以兒茶素作為標準品，其濃度在 4 μg/mL～24 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。方法的相對標準偏差RSD為1.10％，回收率為98.06％～103.89％，可以作為紫山藥中原花青素的測定方法。

[1]劉榮麗.保健食品中原花青素的分析及緩解視疲勞功效研究[D].福州：福建中醫(yī)藥大學,2014

[2]闞曉紅.葡萄籽原花青素對高血壓心肌纖維化的保護作⒚及其分子機制的研究[D].濟南：山東大學,2016

[3]周婷,雷潤梅,趙曉丹,等.花生紅衣中B型二聚體原花青素對丙烯酰胺的抑制效果[J].現(xiàn)代食品科技,2016,32(10)：66-71

[4]鐘益寧,柳歡,吳詩云,等.肉桂枝葉非揮發(fā)部分原花青素含量測定的比較研究[J].中國調(diào)味品,2016,41(8)：110-114

[5]韋琴,梅輝,樂薇,等.板栗殼原花青素的含量測定及其純化工藝研究[J].糧食㈦油脂,2016,29(9)：81-85

[6]汪洋,丁龍,王四清.不同產(chǎn)地黑果枸杞中原花青素和花青素含量研究[J].2016(13)：122-126

[7]陳長應.微波消解-可見分光光度法測定紫甘薯中花青素[J].食品研究㈦開發(fā),2016,37(4)：158-160

[8]彭芳剛.紅蓮外皮原花青素提取、分級分離及分析鑒定[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學,2013

[9] 趙平,宋學娟,張月萍,等.葡萄籽原花青素含量測定[J].河北化工,2007,30(1)：46-49

[10]周秋枝,黃蕾,沈丹華,等.火棘果中原花青素含量測定方法的建立[J].食品工業(yè)科技,2013,85(7)：314-318

[11]鮑俊竹,陳月坤,徐桂花.測定葡萄籽提取物中原花青素含量的方法[J].農(nóng)業(yè)科學研究,2005,26(1)：43-45

Established the Vanillin-HCl Method to Determine the Procyanidins in Purple Yam

WANG Yan-ping， YANG Hui-hui， XU Fang-yan，ZHAO Zheng-rong， GU Yang， CHEN Yue-ying*
（Department of Food Engineering，Henan Vocational College of Agriculture，Zhengzhou 451450，Henan，China）

The vanillin method to determine the concentration of procyanidins in purple yam was established.The experimental conditions were optimized from five aspects： effect of illumination， reaction time，reaction temperature，the amount of vanillin and concentration of hydrochloric acid.The experimental results showed that when 1mL extracting solution of purple yam was injected to volumetric flask， the optimal reaction conditions were as the following： 5mL of 10g/100mL vanillin solution， 3mL of concentrated hydrochloric acid.After diluted to 10mL，the volumetric flask was placed in 20℃ for 10 minutes，and then the absorbance was detected at 500nm.According to the results，the line of range was from 4 μg/mL to 24 μg/mL， the relative standard deviation was 1.10％，and the recoveries were from 98.06％to 103.89％.The results proved that this method could be used for the determination of proanthocyanidins in purple yam.

vanillin-HCl method； procyanidins； purple yam

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.031

2016-11-28

鄭州市普通科技攻關項目（153PKJGG424）；2015年度河南省高等學校優(yōu)秀教學團隊建設;2014年度河南省高等學校“專業(yè)綜合改革試點”項目

王彥平（1983—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品功能㈦營養(yǎng)因子。

*通信作者：陳月英（1964—），女（漢），教授，碩士，研究方向：功能性食品。