邵琳智，謝敏玲，林 峰

(1.廣東出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂膠原膠中氯霉素的殘留量

邵琳智1,2*，謝敏玲1,2，林 峰1，2

(1.廣東出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定蜂膠原膠中氯霉素殘留量的分析方法。樣品用叔丁基甲醚溶解，氫氧化鈉溶液去除黃酮類等雜質(zhì)，叔丁基甲醚層加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸鈉緩沖液反萃氯霉素，反萃溶液調(diào)至堿性后用乙酸乙酯萃取，經(jīng)濃縮、復(fù)溶和過濾后，進(jìn)行測定。采用甲醇-水(65∶35，體積比)為流動相，反相Atlantis T3色譜柱進(jìn)行液相色譜分離，電噴霧負(fù)離子電離(ESI-)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)進(jìn)行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，氯霉素在0.1～5.0 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；方法的定量下限(S/N≥10)為0.3 μg/kg；在0.3、0.6、3.0 μg/kg 加標(biāo)水平下，氯霉素的平均回收率為97.3%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%～6.4%。該法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合獸藥殘留檢測的要求。

蜂膠原膠；氯霉素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)

蜂膠是蜜蜂從植物芽孢或樹干上采集的樹脂，將其混入上顎腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。蜂膠植物來源廣泛，化學(xué)成分復(fù)雜，已鑒定出20余類、300多種天然成分，其中包括100多種黃酮類化合物、100多種芳香類化合物，還有豐富的有機酸、萜烯類物質(zhì)、維生素、木脂體、酶類、礦物元素、氨基酸、多糖等具有生物活性的天然成分[1]。蜂膠具有廣泛的醫(yī)療保健作用，近年來受到越來越多消費者的親睞，其安全性問題也成為廣大消費者關(guān)注的熱點。

氯霉素對人體有嚴(yán)重的副作用，易引起人粒細(xì)胞缺乏病、再生障礙性貧血和溶血性貧血[2]，許多國家和地區(qū)已將其列入食品中禁止使用的藥物名單[3]。但氯霉素作為一種廣譜抗生素，是預(yù)防和治療蜜蜂細(xì)菌性疾病(美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病等)的有效藥物之一[4]，且在蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)中存在濫用情況，導(dǎo)致了該藥物在蜂產(chǎn)品中的殘留。

就檢測儀器而言，目前采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定氯霉素已成國家標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法靈敏度高、抗干擾能力強。但由于蜂膠化學(xué)成分特別復(fù)雜，要檢測其中的氯霉素殘留量，不僅對儀器靈敏度、重現(xiàn)性與選擇性的要求非常高，更關(guān)鍵的問題在于需要良好的樣品前處理手段來提取和凈化目標(biāo)化合物。目前，動物肌肉與內(nèi)臟、水產(chǎn)品、乳制品、蜂蜜和蜂王漿等動物源食品中氯霉素殘留量的檢測方法已比較完善，國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)均可參考[5-12]，但均不適用于蜂膠原膠樣品。對蜂膠原膠樣品而言，可供參考的文獻(xiàn)非常少[13-14]，其化學(xué)成分特別復(fù)雜，檢測其中的痕量獸藥殘留極其困難，至今未有任何檢測蜂膠原膠中獸藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究建立了一種蜂膠原膠中氯霉素殘留量的測定方法，充分應(yīng)用待測物和干擾物在不同溶劑間的溶解度差異，解決了蜂膠原膠樣品的溶解、氯霉素的提取和干擾物的凈化等問題，已成功應(yīng)用于實際樣品的檢測。本方法采用的提取和凈化溶劑尚未見文獻(xiàn)報道，方法新穎，具有首創(chuàng)性，且操作簡便，靈敏度高，抗干擾能力強，定性定量準(zhǔn)確，從而為制訂蜂膠原膠中的獸藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)提供了有力的技術(shù)支持，也為相關(guān)部門監(jiān)管蜂膠安全提供了技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UFLC-XR高效液相色譜儀(日本島津公司)；API3000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；MS3型渦旋振蕩器(德國IKA公司)；Sigma3-30K臺式冷凍離心機(德國Sigma公司)；Turbo Vap LV水浴氮吹儀(美國Biotage公司)；Milli-Q Advangtage A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司)。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度為98.5%，Dr.Ehrenstorfer公司)，氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、叔丁基甲醚(色譜純，F(xiàn)isher公司)；乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉、乙酸鈉(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；實驗用水為超純水(符合GB/T 6682-2008 一級水要求)；分析樣品為實驗室送檢樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取氯霉素10 mg置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃避光保存。將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液和氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，配制成氯霉素質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L，氯霉素-D5質(zhì)量濃度為0.3 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

蜂膠原膠樣品在15 ℃以下時，變脆變硬，易粉碎，若室溫在15 ℃以上，可置于-18 ℃冰箱冷凍2 h以上，取出后立刻敲碎，敲碎后的樣品作為供試樣品。

稱取1.0 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL具塞離心管中，加20 μg/L氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)溶液30 μL，加叔丁基甲醚8 mL，渦旋3 min，使蜂膠充分溶解，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，渦旋2 min，8 000 r/min離心5 min，上層叔丁基甲醚移入另一潔凈50 mL離心管中，先加0.2 mol/L乙酸鈉溶液10 mL，再加正己烷7 mL，渦旋2 min，4 000 r/min離心5 min，下層乙酸鈉溶液移入另一潔凈50 mL離心管中，上層再加0.2 mol/L乙酸鈉溶液5 mL反萃1次，4 000 r/min離心5 min，合并兩次乙酸鈉溶液反萃液，用氨水調(diào)pH值至10±0.2，加乙酸乙酯10 mL，渦旋3 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液45 ℃氮吹濃縮至干，加純水1 mL復(fù)溶，渦旋2 min，過0.22 μm濾膜后，采用HPLC-MS/MS測定。

1.4 HPLC-MS/MS條件

液相色譜條件：色譜柱為Atlantis T3柱(4.6 mm×100 mm，3 μm，Waters公司)；流動相為甲醇-水(65∶35)；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子源模式(ESI-)；多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣(NEB)設(shè)為10；氣簾氣(NEB)設(shè)為10；碰撞氣(CAD)設(shè)為10；噴霧電壓(IS)為-4 000 V；離子化溫度(TEM)為500 ℃；MRM監(jiān)測離子對、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 氯霉素和氯霉素-D5的質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

氯霉素屬于中等極性化合物，在C18柱上有一定的保留，現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)和參考文獻(xiàn)多采用C18柱[5-10]進(jìn)行檢測。本實驗嘗試選擇Atlantis T3柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)測定氯霉素，該柱采用三官能團(tuán)C18烷基鍵合相，保證了鍵合密度能提升極性化合物的保留并且100%水相兼容，專有的端基封尾技術(shù)將更多的游離硅羥基反應(yīng)完全，其鍵合和端基封尾技術(shù)的結(jié)合，不僅提供了完美的峰形，且柱壽命較長。相同規(guī)格的T3柱與C18柱，若保留時間相同，T3柱的有機相比例應(yīng)有所提高。對氯霉素而言，選擇T3柱可將流動相中甲醇的比例提高至65%甚至更高。而甲醇的比例越高，質(zhì)譜離子化越好，響應(yīng)越高。本實驗最終選擇Atlantis T3柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)。其他儀器條件，如質(zhì)譜條件可參考氯霉素測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

蜂膠原膠的成分特別復(fù)雜，其他動物源食品，如動物肌肉與內(nèi)臟、水產(chǎn)品、乳制品、蜂蜜和蜂王漿的前處理方法完全不適于蜂膠原膠。而以蜂膠為原料的保健品由于制劑輔料的加入，在有機溶劑中的溶解度發(fā)生變化，所以方法也不適用[15]。提取蜂膠中的氯霉素，首先需將蜂膠原膠完全溶解。蜂膠原膠可溶于2%NaOH、乙醇和醚類。有文獻(xiàn)采用NaOH和乙醇溶解蜂膠[13-14]，高氯酸溶液和水提取其中的氯霉素，但加入提取液后均會立即產(chǎn)生大量膠狀沉淀，從而導(dǎo)致氯霉素包裹在沉淀中，難以提取出來。本實驗采用叔丁基甲醚溶解蜂膠原膠，蜂膠中大量的黃酮類化合物等雜質(zhì)可用氫氧化鈉溶液去除，而氯霉素仍保留在叔丁基甲醚層中。去除蜂膠中的黃酮類干擾物是凈化的關(guān)鍵步驟，有文獻(xiàn)采用乙酸鉛沉淀法[14]，但由于乙酸鉛主要與具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物形成沉淀，不能去除其他不含此結(jié)構(gòu)的化合物。本實驗比較了0.2%、1%和4%氫氧化鈉溶液的除雜質(zhì)效果，結(jié)果顯示，4%的氫氧化鈉溶液能去除絕大部分黃酮類化合物，而且還能溶解部分樹膠等物質(zhì)，凈化效果較好，因此最終選擇4%的氫氧化鈉溶液去除雜質(zhì)。

由于叔丁基甲醚與水溶液不互溶，可采用緩沖液將氯霉素反萃取出來，氯霉素在叔丁基甲醚中有一定的溶解度，直接加緩沖液難以將其反萃出來，故在叔丁基甲醚層中加入一定量的正己烷以降低氯霉素的溶解度，再用乙酸鈉緩沖液反萃取氯霉素。本實驗優(yōu)化了正己烷的加入量，使正己烷與叔丁基甲醚的體積比分別為0.5∶1、1∶1、2∶1，結(jié)果表明正己烷比例過低時，氯霉素不易被反萃取出來，過多則會出現(xiàn)膠狀沉淀，導(dǎo)致氯霉素易包裹其中，降低其回收率。當(dāng)正己烷與叔丁基甲醚體積比為1∶1時能獲得滿意結(jié)果。反萃取溶液調(diào)至堿性后用乙酸乙酯萃取，若反萃取溶液pH值低于7.0，乙酸乙酯對氯霉素的萃取效率較差，pH值越低，萃取效率越差，調(diào)至堿性后，一次即可將氯霉素完全萃取出來。溶液pH值對氯霉素絕對回收率的影響結(jié)果表明，pH 10.0時的萃取效率最為理想。

通過上述幾次液液萃取，完成了氯霉素的提取和凈化，整個過程中氯霉素始終保留在溶解度相對較大的溶劑中，條件溫和，凈化效果顯著。經(jīng)上述優(yōu)化方法前處理后，氯霉素的空白和加標(biāo)樣品色譜圖見圖1。

2.3 線性范圍、方法檢出限與定量下限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)以及電噴霧離子化的不穩(wěn)定性對測定結(jié)果的影響，本方法采用同位素稀釋技術(shù)，取不同濃度的氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以氯霉素響應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)氯霉素-D5響應(yīng)峰面積之比(y)對氯霉素的質(zhì)量濃度(x，μg/L)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，氯霉素的質(zhì)量濃度在0.1～5.0 μg/L范圍時，方法的線性關(guān)系良好，線性方程為y= 3.34x+0.015，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8。在空白蜂膠中添加不同質(zhì)量濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法處理樣品，當(dāng)信噪比S/N≥3時，確定方法的檢出限(LOD)為0.1 μg/kg，當(dāng)S/N≥10且回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合殘留檢測方法要求，確定方法的定量下限(LOQ)為0.3 μg/kg。

2.4 方法的回收率與精密度

采用在空白蜂膠中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收率試驗，內(nèi)標(biāo)法校正，分別按照低(LOQ)、中(2 LOQ)、高(10 LOQ)3個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測定，每個水平平行測定6個樣品，結(jié)果表明，氯霉素的平均回收率為97.3%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.8%～6.4%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。

2.5 實際樣品分析

應(yīng)用本方法對實驗室送檢的50個蜂膠原膠樣品進(jìn)行檢測，其中有6個樣品檢出氯霉素，含量分別為1.3、2.1、2.5、3.6、14、46 μg/kg，其余樣品結(jié)果均低于定量下限(0.3 μg/kg)。

3 結(jié) 論

本文采用新穎的提取和凈化溶劑，利用目標(biāo)化合物和干擾物在不同溶劑間的溶解度差異，解決了蜂膠原膠樣品的溶解、氯霉素的提取和分離等難題，建立了一種蜂膠原膠中氯霉素殘留的HPLC-MS/MS檢測方法。本方法簡便快捷，靈敏度高，抗干擾能力強，符合殘留檢測的相關(guān)要求，可為蜂膠原膠的監(jiān)管提供有效的方法支撐。

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Determination of Chloramphenicol in Propolis by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHAO Lin-zhi1,2*，XIE Min-ling1,2，LIN Feng1，2

(1.Inspection and Quarantine Technical Centre of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510623，China；2.Key Laboratory of Animals and Plants and Food Import and Export of Technical Measures in Guangdong Province，Guangzhou 510623，China)

A method was developed for the determination of chloramphenicol in propolis by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The flavonoid was removed with NaOH after the dissolution of the sample with methyl tert-butyl ether(MTBE).The solubility of chloramphenicol in MTBE was decreased withn-hexane，and then chloramphenicol was extracted with sodium acetate buffer.After the extraction was transferred to alkaline solution，ethyl acetate was used to extract chloramphenicol.The supernatant was evaporated,and re-dissolved with water for detection.The separation of chloramphenicol was performed on an Atlantis T3column with methanol and water(65∶35，by volume) as mobile phases，and the detection of chloramphenicol was carried out by tandem mass spectrometry in negative electrospray ionization(ESI-) and multiple reaction monitoring(MRM) mode.The quantification was performed by the internal standard method.The calibration curve showed a good linearity in the range of 0.1-5.0 μg/L.The limits of quantitation(S/N≥10) were 0.3 μg/kg.The recoveries at three spiked levels were in the range of 97.3%-103%with relative standard deviations of 4.8%-6.4%.With the advantages of sensitivity，strong anti-interference capability，good recovery and repeatability，the method was suitable for the monitoring of veterinary residue analysis

propolis;chloramphenicol；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

2017-04-05；

2017-05-10

廣東省省級科技計劃項目(2015A030401075)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.014

O757.72； TQ460.72

A

1004-4957(2017)08-1029-05

*通訊作者：邵琳智，碩士，高級工程師，研究方向：食品分析，Tel：020-38290337，E-mail：slz9741430@sina.com