董云龍 劉明輝 李永文 李穎 趙辰龍 袁茵 杜暉 張子禾 張洪兵 劉紅雨 陳軍

肺癌已經躍居腫瘤發(fā)病率之首，成為癌癥死亡的主要原因。肺癌發(fā)病的根本原因，在于體內原癌基因的激活或者抑癌基因的失活，致使細胞惡性增殖及不可逆轉化，最終導致癌癥的發(fā)生[1-4]。RB基因（視網膜細胞瘤基因）是人體內重要的抑癌基因，通過控制細胞周期的進程，抑制細胞的過度增殖。Rb-E2F信號通路是調控細胞周期G1后期通過限速點R到S期的關鍵信號分子和通路，通常情況下，Rb與E2F1結合，使E2F1沒有活性，但在腫瘤中經常由于突變、雜合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）、甲基化或磷酸化等原因使Rb失活，使之釋放出與之結合的轉錄因子E2F1，E2F1可促進cyclin E、cyclin A等能控制細胞分裂的基因的轉錄，使細胞周期進展，細胞增殖[5-11]。多項研究已經證實，在肺癌中普遍存在Rb蛋白的表達異常。比如，有研究顯示非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中約20%-40%存在Rb蛋白表達降低。另有研究提示，NSCLC中約12.5%的患者存在Rb的表達降低，在不同的肺癌類型中，表達情況不同，其中鱗癌中約有5.5%，肺腺癌中有19.4%。其他研究顯示在大細胞肺癌、小細胞肺癌的突變率較高，約68%和87%[12-14]。因此Rb的異常普遍存在于肺癌中，是肺癌重要的發(fā)病因素。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因作為肺腺癌重要的驅動基因（diver gene），在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。EGFR信號通路一旦被激活，可導致腫瘤細胞內酪氨酸蛋白激酶活化和受體自身磷酸化，從而促使細胞增生、分化、轉移、血管生成及凋亡抑制。EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKI）通過阻斷細胞受體的三磷酸腺苷結合位點，阻止下游信號傳遞而產生腫瘤抑制作用。在具有EGFR突變的NSCLC患者中，使用EGFR-TKI療效優(yōu)于傳統的化療，且毒副作用小，患者耐受性好。EGFR外顯子19或/和21的突變異常將導致EGFR結合ATP的能力增加，從而加強了TKI的療效因此，具有EGFR突變的NSCLC患者是EGFRTKI治療的優(yōu)勢人群，而女性、非吸煙的腺癌患者，其EGFR突變發(fā)生頻率更高，成為EGFR-TKI治療的優(yōu)勢人群[15-20]。

在EGFR突變的肺腺癌患者中Rb及磷酸化Rb的表達情況未見文獻報道。本研究將利用免疫組化技術，分析23例具有EGFR突變的肺腺癌患者腫瘤組織中Rb及磷酸化pRb-780、pRb-795的表達情況，分析在具有EGFR突變的患者中Rb的異常表達與患者臨床病理生理特征的關系以及與患者預后的關系，探討EGFR信號通路與Rb信號通路是否具有協同性。

1 材料與方法

1.1 患者的基本信息以及臨床資料 23例EGFR突變的肺腺癌患者標本取自天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺部腫瘤外科2014年1月-2015年12月手術患者，術后病理診斷為肺腺癌。術前未接受放療、化療及分子靶向治療。EGFR突變檢測分別由廣州益善公司和廣州燃石公司完成。表1列出了23例患者的詳細臨床信息。共有14例男性，9例女性，年齡26歲-71歲，中位年齡62歲，吸煙者11例，不吸煙12例，臨床I期/II期10例，III期/ IV期13例；EGFR 19外顯子突變患者11例，21外顯子突變9例，20外顯子突變2例，其他位點突變有1例（表1）。

1.2 免疫組化 23例組織標本均由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科常規(guī)固定、包埋，切片。4 μm-6 μm厚的常規(guī)病理石蠟切片，70 °C烤片40 min，脫蠟，脫水后，經Tris/EDTA修復液（pH8.0）進行抗原修復，正常羊血清RT封閉30 min，加入一抗4 °C過夜，經生物素化的二抗37 °C 30 min，辣根酶標記的鏈霉素卵白素工作液37 °C 30 min，DAB顯色液顯色，蘇木素復染?？贵w稀釋倍數為1:20-1:100。Rb、pRb-780、pRb-795兔抗人多克隆抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

Rb、pRb-780、pRb-795陽性染色呈棕黃色或者黃褐色顆粒，三種蛋白主要在細胞核中表達，由于Rb基因的雜合缺失可以導致正常Rb蛋白表達缺失或者表達一種不完全的Rb蛋白，這一部分的Rb蛋白不進入細胞核，所以可能導致細胞質的輕度著色，所以在免疫組化染色中會出現一部分在細胞質染色的病例，我們將其劃歸為非特異染色[12,21]。Rb的結果判定：根據在400×高倍鏡下比較23例肺癌組織標本和同一例患者癌旁肺組織的陽性染色程度，對陽性染色的癌組織以及癌旁肺組織的陽性染色進行評分，若肺癌組織中染色強度比癌旁肺組織強或者相同，則判斷為無表達降低/缺失，若癌組織染色比癌旁肺組織染色弱或無，即判定為Rb蛋白表達降低或缺失。pRb的判定：根據400×高倍鏡下，若肺癌組織中陽性染色強度比癌旁肺組織高，則判斷為Rb過度磷酸化，若癌組織染色與癌旁肺組織染色相同或弱，即判定無Rb過度磷酸化。切片不加入一抗，作為空白對照。

1.3 統計學分析 統計軟件采用SPSS 20.0進行數據分析，用卡方檢驗及非參數檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 Rb及pRb-780、pRb-795在EGFR突變肺腺癌患者中的表達情況 Rb蛋白主要在細胞核中表達，一部分病例陽性染色細胞排列呈巢狀，周圍被結蹄組織分割，另可見部分患者的細胞排列成腺腔樣（圖1）。在23例肺腺癌患者中，16例（16/23, 69.6%）存在表達降低/缺失。Rb的表達情況與患者臨床病理生理特征分析后發(fā)現，在不同年齡、性別、吸煙史、臨床分期、腫瘤位置及不同的EGFR突變位點的患者中未見顯著性差異。

表 1 患者的統計資料Tab 1 Patient demographics

圖 1 Rb（A、B）及pRb-780（C、D）、pRb-795（E、F）免疫組化結果示意圖。Rb在肺腺癌組織細胞（B）中較癌旁肺組織（A）中表達減低；pRb-780和pRb-795在肺腺癌組織（D、F）中比癌旁肺組織（C、E）中過表達。Fig 1 Representative Rb (A, B), pRb-780 (C, D), pRb-795 (E, F) immunostaining results. Reduced expression of Rb in adenocarcinoma cells were detected (B) compared to adjacent lung tissue cells (A). pRb-780 and pRb-795 were overexpressed in adenocarcinoma (D, F) compared to adjacent lung tissue cells (C, E).

表 2 23例肺癌患者中Rb and p-Rb的表達情況以及臨床信息Tab 2 The expression of Rb and p-Rb in 23 lung cancer patients by immunohistochemical staining and their clinical characteristics

表 3 23例肺癌患者的生存時間Tab 3 The survival time of 23 lung cancer patients

pRb-780表達與Rb類似，表達于細胞核中，大部分陽性腫瘤細胞排列成腺腔樣；可見部分排列成巢狀，呈鱗狀分化，周圍可被纖維組織分隔；少數的病例陽性表達的腫瘤細胞散在分布。在同一病例中可見不規(guī)則分布的從低到高度的表達差異。23例患者中有17例患者存在pRb-780染色增強，即pRb-780過表達，占73.9%。分析患者例臨床信息與pRb-780蛋白表達的關系發(fā)現，III期/IV期患者中與I期/II期患者相比，pRb-780蛋白過表達率更高，差異有統計學意義（P=0.022）；未發(fā)現與年齡、性別、吸煙史、腫瘤位置等臨床信息相關。

pRb-795同樣主要在細胞核中表達，陽性腫瘤細胞排列成巢狀、腺腔樣、偶爾可見呈乳頭狀排列。16例（16/23, 69.6%）患者存在pRb-795的過表達。通過分析pRb-795蛋白的表達情況與患者臨床病理生理特征發(fā)現：與I期/II期患者相比，III期/IV期有更多的患者存在pRb-795的過表達，但是差異不顯著（P=0.074）；其他未見明顯差異（表2）。

綜合分析發(fā)現，23例患者均存在Rb表達降低和/或pRb增加。

2.2 Rb、pRb-780、pRb-795表達情況與EGFR突變肺腺癌患者的預后分析 在23例患者中，有20例具有完整的隨訪信息，其中，死亡3例，至今生存17例。我們進一步依據其Rb、pRb-780、pRb-795的表達情況進行了生存期的初步分析。在Rb表達無降低和表達降低的患者，生存時間分別為26個月和24.8個月；pRb-780表達增強和無增強的患者，生存時間分別為24.8個月和26.1個月，pRb-795表達增強和無增強的患者，生存時間分別為24.8個月和26.5個月；存在Rb表達異常的患者以及P-Rb過表達的患者生存時間短，但是統計學未見差異（表3）。

3 討論

Rb屬于 “袋蛋白”（Pocket Protein）家族，在細胞周期的調控中起到關鍵作用[22]。各種原因導致的Rb異常及功能缺失均可導致細胞周期及細胞增殖異常。而LOH導致的Rb表達降低以及各種原因導致的Rb過度磷酸化是Rb失活的重要機制[23]。如Witkiewicz報道[24]稱在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，Rb的失活是由許多相互協調的機制導致的，約50%的乳腺癌病人中可見cyclin D1的過表達，導致了Rb的磷酸化而失去功能；20-30%的乳腺癌患者中可見Rb基因的丟失；還有部分患者是由于P16的失活導致了Rb的磷酸化失活。為了探討在具有EGFR突變的患者中Rb的存在狀態(tài)，我們選用23例有EGFR突變的肺腺癌標本，應用免疫組化分別檢測了Rb、pRb-780和pRb-795位點的蛋白表達情況，發(fā)現Rb的異常表達普遍存在于EGFR突變的肺腺癌患者中：約70%的患者存在Rb的表達降低/缺失，約70%的患者存在Rb的過度磷酸化，而100%的患者存在Rb的低表達或過度磷酸化，提示在EGFR突變的肺腺癌患者中，普遍存在Rb異常所導致的細胞周期異常。細胞周期異常是EGFR突變肺腺癌患者重要的發(fā)病機制。進一步可在細胞和動物模型水平探討使用細胞周期抑制劑是否能有效抑制EGFR突變細胞的惡性增殖，將會是一個有益的嘗試。

以往文獻報道在NSCLC中，采用免疫組化方法檢測到的Rb表達減弱或缺失的百分率為20%-40%左右，也有作者報道，在肺腺癌中，Rb表達減弱或缺失的頻率高于鱗癌，而我們檢測到在具有EGFR突變的肺腺癌患者中，Rb表達減弱或缺失的百分率為70%左右，遠遠高于文獻報道的NSCLC患者中的百分率，是否提示在具有EGFR突變的肺腺癌中Rb的表達缺失/降低頻率高于其他病例。由于本研究只采用了免疫組化的方法檢測，需要進一步采取手段檢測是否存在LOH、甲基化、突變等導致Rb表達減弱或缺失的機制。

本實驗中23例EGFR突變的肺腺癌患者中Rb蛋白缺失或減弱以及Rb的過度磷酸化與患者的生存時間沒有顯著性差異，但是能看出，存在Rb蛋白缺失或減弱的以及存在Rb的高度磷酸化的患者生存時間偏短，推測是由于病例數偏少與隨訪時間不夠造成的。