張坤鵬 趙格非 肖汀 李萍 宋杰 高燕寧 孫克林

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率均居各種惡性腫瘤首位，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前已知多種基因在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[2]。隨著分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，尋找肺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因，研究它們的表達(dá)與肺癌的診斷、預(yù)后判斷和治療的關(guān)系，一直是基礎(chǔ)和臨床共同努力的目標(biāo)[3]。

為了進(jìn)一步研究肺癌的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期工作中通過(guò)抑制性消減雜交文庫(kù)（suppression subtractive hybridization, SSH）等高通量手段建立了中國(guó)人肺癌相關(guān)差異表達(dá)基因文庫(kù)[4]。通過(guò)功能篩選，成功克隆出在肺癌組織中表達(dá)顯著升高的肺癌相關(guān)基因OLC1（overexpressed in lung cancer 1），并通過(guò)免疫組化等證實(shí)OLC1在肺腺癌、鱗癌、小細(xì)胞肺癌組織中均有較高陽(yáng)性表達(dá)率[5]。在肺癌患者外周血中的OLC1蛋白水平，也顯著高于正常健康對(duì)照組[6]。有研究報(bào)道，OLC1在食管鱗癌、卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌組織中均檢測(cè)到較高陽(yáng)性表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)[7-10]。但OLC1在肺癌患者組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系尚不確切，因此本研究的目的在于揭示OLC1在肺癌組織中的表達(dá)與臨床特征和預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 肺癌組織芯片：上海芯超生物科技有限公司（HLug-Ade180Sur-01, HLug-Squ150Sur-01），兩張組織芯片分別包含90例肺腺癌和75例肺鱗癌患者的癌組織，年齡30歲-84歲，平均年齡62.3歲。所有患者均接受外科手術(shù)切除腫瘤組織，手術(shù)時(shí)間2004年7月-2009年6月，所有患者均具有完整的術(shù)前臨床信息、術(shù)后病理分型分期及隨訪信息，隨訪截至2014年8月。另外33例鱗癌標(biāo)本來(lái)源于2008年1月-2009年4月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院接受外科手術(shù)切除的肺癌患者，取自病理科石蠟切片。年齡41歲-74歲，平均年齡58.3歲，患者具有完整臨床及隨訪信息，隨訪截至2015年11月。

1.2 方法 組織芯片和石蠟切片的的免疫組化均采用SP法。免疫組化一抗來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室前期制備，利用OLC1全長(zhǎng)蛋白作為抗原制作的單克隆鼠抗，通過(guò)Western blot檢測(cè)篩選后獲得[6]。一抗工作濃度1:100，1×PBS稀釋，室溫孵育1 h。二抗來(lái)源于購(gòu)自北京中杉金橋公司的即用型山羊抗鼠/兔通用型IgG，二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，在顯微鏡下控制染色強(qiáng)度，蘇木素染核1 min-2 min，乙醇逐步脫水后樹(shù)膠封片。本研究采用1×PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，采用過(guò)表達(dá)的肺癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片，判斷結(jié)果。根據(jù)切片在顯微鏡下觀察，由細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分之積進(jìn)行判定。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性率≤5%計(jì)0分，5%＜陽(yáng)性率≤25%計(jì)1分，25%＜陽(yáng)性率≤50%計(jì)2分，50%＜陽(yáng)性率≤75%計(jì)3分，75%＜陽(yáng)性率≤100%計(jì)4分。著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。取兩者乘積進(jìn)行分級(jí)：0分為（-），1-4分為（+），5-8分為（++），9-12分為（+++）。本研究將（+++）定義為OLC1蛋白過(guò)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，OLC1在肺癌組織中的過(guò)表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系中分類變量采用卡方檢驗(yàn)。與預(yù)后之間的關(guān)系采用Kaplan-Meier進(jìn)行單因素分析，再利用Cox多因素回歸分析驗(yàn)證各影響因素與總體生存期的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OLC1在肺癌組織中的表達(dá)情況 在198例組織中，組織芯片免疫組化染色脫片7例，最終納入研究191例，其中腺癌88例，鱗癌103例，總體5年生存率為44.4%，鱗癌5年生存率為56.5%，腺癌患者5年生存率為30%。免疫組化染色的結(jié)果顯示OLC1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)存在差異（圖1），OLC1在88例肺腺癌中的過(guò)表達(dá)率為87.5%，103例肺鱗癌中的過(guò)表達(dá)率為55.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，OLC1在腺癌組織中的過(guò)表達(dá)與年齡、性別、病理分級(jí)、腫瘤直徑、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性。在103例肺鱗癌患者中，OLC1過(guò)表達(dá)與臨床特征的分析顯示，OLC1在年齡≥60歲（P=0.002）的患者中更易出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，OLC1的過(guò)表達(dá)與腫瘤分化程度、性別、腫瘤分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（表1）。

2.2 OLC1在肺腺癌和鱗癌組織中的過(guò)表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系對(duì)肺腺癌患者進(jìn)行的Kaplan-Meier生存分析顯示，OLC1的過(guò)表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后無(wú)關(guān)（P=0.816）。肺鱗癌患者的生存資料單因素分析顯示OLC1在癌組織中的過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后存在相關(guān)性（Log-rank χ2=4.12，P=0.042，圖2A），OLC1過(guò)表達(dá)組與非過(guò)表達(dá)組的5年生存率分別為50.9%和67.4%。為了排除混雜因素影響，我們采用Cox多因素回歸分析進(jìn)行驗(yàn)證。納入與預(yù)后關(guān)系較為密切的性別、年齡、分化程度、TNM分期以及OLC1在癌組織中過(guò)表達(dá)，共5個(gè)因素進(jìn)行Cox多因素回歸分析。結(jié)果顯示，OLC1表達(dá)不同的兩組之間總生存差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.05，表2，圖2B）。OLC1在癌組織中的表達(dá)與年齡存在一定的關(guān)聯(lián)，在≥60歲的患者中更易表達(dá)，以上的分析顯示OLC1過(guò)表達(dá)和年齡≥60都是可能影響預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素，本研究將OLC1過(guò)表達(dá)和年齡兩個(gè)因素聯(lián)合進(jìn)行分析。單因素Kaplan-Meier生存分析顯示，OLC1過(guò)表達(dá)且年齡≥60歲組的預(yù)后顯著差于OLC1非過(guò)表達(dá)且年齡＜60歲組（log-rank χ2=8.392，P=0.004，圖3A）。納入性別、分化程度、TNM分期共同進(jìn)行多因素分析也顯示，鱗癌患者OLC1過(guò)表達(dá)且年齡≥60歲時(shí)，預(yù)后顯著變差（HR=5.125，95%CI 1.756-14.96，P=0.003，圖3B）。

3 討論

表 1 OLC1在鱗癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Tab 1 Association between clinical features and OLC1 expression in Lung SCC tissues

表 2 肺鱗癌患者總生存期的單因素和Cox多因素分析Tab 2 The univariate and multivariate Cox analysis for overall survival in lung SCC patients

圖 1 OLC1在不同組織中的表達(dá)情況。利用OLC1單克隆鼠抗體在組織芯片中用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)OLC1在癌旁正常肺組織和肺癌組織中的表達(dá)。A：OLC1在正常肺組織中不表達(dá)；B：OLC1在鱗癌中弱表達(dá)；C：OLC1在鱗癌中高表達(dá)；D：OLC1在腺癌中高表達(dá)。Fig 1 The expression of OLC1 in different tissues OLC1 expression in adjacent normal lung tissues and lung cancer tissues, as observed by immunohistochemical staining with a rat monoclonal antibody against OLC1 applied to the tissue microarrays.A: OLC1 was not expressed in adjacent normal lung tissues; B: OLC1 was lowly expressed in squamous cell carcinoma tissues; C: OLC1 was overexpressed in squamous cell carcinoma tissues; D: OLC1 was overexpressed in lung adenocarcinoma tissues.

圖 2 OLC1在鱗癌組織中的過(guò)表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。A：過(guò)表達(dá)組與非過(guò)表達(dá)組Kaplan-Meier生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)提示OLC1高表達(dá)組比低表達(dá)組預(yù)后差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042, n=103）。B：多因素Cox回歸分析顯示OLC1過(guò)表達(dá)組的預(yù)后較差，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.05, n=103）。Fig 2 Correlation of the OLC1 overexpression in lung SCC tissues with prognosis. A：Kaplan-Meier survival curve of patients with or without OLC1 overexpression in lung SCC tissues, Log-rank test showed that the OLC1 overexpressed group had a poorer prognosis (P=0.042, n=103). B:Multivariate Cox regression analysis showed that the OLC1 overexpressed group had a poorer prognosis than another group, without statistical significance (P=0.046, n=65).

圖 3 OLC1過(guò)表達(dá)與年齡≥60歲共同影響鱗癌患者的預(yù)后 A：?jiǎn)我蛩豄aplan-Meier生存分析顯示，OLC1過(guò)表達(dá)且年齡≥60歲組比OLC1非過(guò)表達(dá)且年齡＜60歲組生存顯著降低（P2=0.004）、僅OLC1過(guò)表達(dá)或年齡≥60歲不能作為影響鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P1=0.062）；B：多因素Cox回歸分析顯示，OLC1過(guò)表達(dá)且年齡≥60歲組的生存較差（P2=0.003）。Fig 3 OLC1 overexpressed combined with age ≥60 years together influence the prognosis of lung SCC patients. A: Univariate Kaplan-Meier survival curve showed that the OLC1 overexpressed & age ≥60 years group had a poorer prognosis (P2=0.004). Only with one of the factors of OLC1 overexpressed and age ≥60 years could not be an independent risk factor influence the prognosis of lung SCC (P1=0.062). B: Multivariate Cox regression analysis showed that the OLC1 overexpressed & age≥60 years group had a poorer prognosis (P2=0.003）.

肺癌作為世界上發(fā)病率和死亡率均居各種惡性腫瘤首位的疾病[1]，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有一系列的基因和蛋白發(fā)生差異性表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡等步驟。關(guān)于肺癌發(fā)病的分子病理機(jī)制以及基因和蛋白的功能、表達(dá)水平改變的研究一直是尋找肺癌治療新方法的重要途徑。OLC1是在肺鱗癌新鮮腫瘤組織中篩選克隆出的肺癌相關(guān)新基因，定位于16q22.2[4]。在本課題組前期研究中，OLC1在肺癌患者外周血漿中的蛋白水平也顯著高于健康人。OLC1的瞬時(shí)表達(dá)能引起IkappaB-α的磷酸化，使NF-kappaB向細(xì)胞核移位，從而激活NF-kappaB通路。在肺鱗癌的發(fā)生早期即不典型增生和原位癌階段，就已經(jīng)可以檢測(cè)到OLC1表達(dá)的升高，因此推測(cè)OLC1可能通過(guò)激活NF-kapppaB通路介導(dǎo)肺癌早期癌變的發(fā)生[5]。

OLC1的表達(dá)可能與肺癌患者的吸煙史以及鱗癌的進(jìn)展存在一定關(guān)聯(lián)。張曉靜等[11]通過(guò)制備香煙凝集物作用于肺癌細(xì)胞系的研究表明，香煙凝集物通過(guò)抑制OLC1蛋白泛素化降解過(guò)程，引起OLC1的高表達(dá)，OLC1的高表達(dá)可能通過(guò)促進(jìn)BRCA1蛋白泛素化降解下調(diào)，導(dǎo)致抑癌基因BRCA1表達(dá)下調(diào)。有吸煙史的鱗癌患者外周血漿中OLC1蛋白水平明顯高于無(wú)吸煙史患者[6]，并與鱗癌患者的吸煙史直接相關(guān)，可能提示吸煙致癌的原理和OLC1與鱗癌發(fā)生發(fā)展的重要關(guān)系。而本研究結(jié)果顯示，OLC1盡管在腺癌組織中的表達(dá)率明顯高于鱗癌，但在鱗癌中的差異表達(dá)可能提示OLC1與鱗癌的預(yù)后及臨床特點(diǎn)關(guān)系更為密切。而由于本研究為回顧性研究，在組織芯片的臨床信息中未包含準(zhǔn)確的吸煙史信息，未能對(duì)OLC1在組織中的表達(dá)與吸煙的關(guān)系進(jìn)行分析。

既往研究及本研究結(jié)果提示OLC1可能與多種腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。在關(guān)于OLC1在食管鱗癌中的研究表明，OLC1高表達(dá)以后，可能通過(guò)阻礙天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的激活和增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）的穩(wěn)定性來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，從而引起惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[9]。OLC1不僅在肺癌組織中高表達(dá)，研究表明，OLC1還在乳腺癌、卵巢癌、食管鱗癌、結(jié)腸癌組織中高度表達(dá)，并與不良預(yù)后直接相關(guān)[7-10]。因此OLC1可能是具有原癌基因?qū)傩缘模⑶宜谋磉_(dá)調(diào)控有可能參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，但關(guān)于OLC1如何發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，參與這些腫瘤進(jìn)展的機(jī)制尚缺乏進(jìn)一步研究。在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌研究中的結(jié)果顯示，OLC1在癌組織中表達(dá)陽(yáng)性（++/+++）是與術(shù)后的不良預(yù)后直接相關(guān)的，在卵巢癌組織中OLC1高、低表達(dá)組的5年生存率分別為24.8%和75.2%[8]。本研究對(duì)OLC1的表達(dá)與肺鱗癌患者預(yù)后進(jìn)行生存分析，我們首先按照OLC1表達(dá)陰性（-/+）和陽(yáng)性（++/+++）進(jìn)行分組，兩組之間的生存無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.153）。進(jìn)一步按照是否為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行分組發(fā)現(xiàn)，OLC1在鱗癌組織中的過(guò)表達(dá)（+++）與不良預(yù)后相關(guān)，過(guò)表達(dá)組與非過(guò)表達(dá)組5年生存率分別為50.9%和67.4%，單因素分析顯示兩組間預(yù)后存在顯著差異（P=0.042），提示在本研究中OLC1的表達(dá)與肺鱗癌患者的不良預(yù)后存在一定的關(guān)系：鱗癌組織中OLC1表達(dá)較強(qiáng)可能提示患者手術(shù)治療后預(yù)后更差。進(jìn)一步納入性別、年齡、分化程度、TNM分期以及OLC1在癌組織中過(guò)表達(dá)這5個(gè)影響因素，進(jìn)行多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，OLC1差異表達(dá)的兩組之間生存期無(wú)統(tǒng)計(jì)差異（P=0.05），僅有TNM分期可以作為影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但可以看到多因素回歸分析中，OLC1過(guò)表達(dá)的P值處于臨界狀態(tài)，而本研究為單中心回顧性小樣本手術(shù)治療患者資料，可能存在偏倚，因此并不能完全否定OLC1過(guò)表達(dá)預(yù)測(cè)鱗癌患者預(yù)后的價(jià)值，未來(lái)仍需擴(kuò)大樣本量、同時(shí)考慮輔助治療等因素的作用，進(jìn)一步研究OLC1過(guò)表達(dá)對(duì)鱗癌患者預(yù)后的影響。

OLC1的過(guò)表達(dá)與年齡相關(guān)，并可能與年齡一起共同影響鱗癌患者的預(yù)后。OLC1在鱗癌患者中的過(guò)表達(dá)與臨床因素進(jìn)行分析后的結(jié)果分析顯示，OLC1在年齡≥60歲的患者中更易表達(dá)。對(duì)鱗癌患者的預(yù)后資料進(jìn)行的多因素分析發(fā)現(xiàn)，OLC1在癌組織中的過(guò)表達(dá)和年齡≥60歲是除TNM分期以外可能影響鱗癌患者預(yù)后的重要因素。因此本研究對(duì)OLC1過(guò)表達(dá)和年齡兩個(gè)因素聯(lián)合后進(jìn)行分析，結(jié)果顯示OLC1非過(guò)表達(dá)且年齡＜60歲患者具有最好的預(yù)后，OLC1過(guò)表達(dá)且年齡≥60歲組的預(yù)后顯著變差。說(shuō)明OLC1的過(guò)表達(dá)可能與年齡≥60歲相關(guān)并共同影響鱗癌患者的預(yù)后，可能作為鱗癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。

綜上所述，OLC1在腺癌中的過(guò)表達(dá)率明顯高于鱗癌，但目前研究并未發(fā)現(xiàn)OLC1在癌組織中的過(guò)表達(dá)與腺癌的預(yù)后相關(guān)。OLC1在鱗癌組織中的過(guò)表達(dá)與年齡呈相關(guān)性，更易在≥60歲的鱗癌患者組織中表達(dá)，且OLC1在鱗癌組織中的過(guò)表達(dá)與患者的不良預(yù)后存在一定的關(guān)聯(lián)，因此OLC1在鱗癌組織中表達(dá)的研究可能為發(fā)現(xiàn)新的肺鱗癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)因素，進(jìn)行危險(xiǎn)分層指導(dǎo)綜合治療提供幫助。未來(lái)仍需進(jìn)一步研究OLC1表達(dá)差異的原因和影響預(yù)后的機(jī)制。