何海洋 齊陸玉 肖永生 侯伊玲

腫瘤細胞可以逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視即免疫逃逸，以往的研究主要集中在腫瘤細胞在免疫逃逸中自身的改變，關于腫瘤微環(huán)境對免疫逃逸的影響知之甚少。腫瘤相關成纖維細胞（tumor-associated fibroblasts, TAF）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，它不同于正常的纖維細胞，具有特殊的生理、生化特點，可抑制免疫細胞的功能[1]。TAF表達跨膜蛋白——成纖維細胞激活蛋白α（fibroblast activation protein α, FAPα），在糖基化形態(tài)下具有二肽肽酶及膠原酶活性的同源二聚體。FAPα選擇性地表達于90%以上的人上皮性腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、結直腸癌及卵巢癌等基質成纖維細胞的包膜或胞漿中，良性及癌前病變的上皮腫瘤中 FAPα表達通常為陰性[2]（對于非腫瘤組織，F(xiàn)AP表達于胰腺細胞及傷口愈合的基質纖維瘤細胞表面）。

目前已知的TAF細胞的主要功能包括：①細胞表面FAP通過發(fā)揮二肽基肽酶和肽鏈內切酶活性，降解和重建腫瘤與宿主之間的基質，促進腫瘤細胞向膠原底部遷移，從而有利于腫瘤細胞從原發(fā)部位脫離，協(xié)助癌細胞侵襲和遠距離轉移[3]；②通過產生 VEGF、FGF等血管內皮細胞生長因子或招募內皮祖細胞，誘導腫瘤基質中血管內皮細胞網絡的形成，促進腫瘤血管生成從而促進腫瘤進展[4]；③免疫抑制功能：分泌TGF-β（transforming growth factor-β）、白介素-10（interleukin-10, IL-10）、IL-4、IL-1B以促進Treg（regulatory cells）、腫瘤相關巨噬細胞的生成[5]；分泌生長因子、細胞因子、蛋白酶、胞外基質蛋白，干擾T細胞免疫應答；抑制免疫效應細胞。

在腫瘤免疫中CD8+T細胞發(fā)揮重要的作用，T細胞的細胞膜上有一類分子對T細胞的激活具有負調節(jié)作用，這類分子被稱為共抑制分子。主要的共抑制分子包括細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4, CTLA-4）和程序性死亡受體 1（programmed death 1, PD-1）。PD-1[6]表達于多種細胞表面，在外周遇到相應的配體 PD-L1（programmed death factor ligand 1, PD-L1）時被激活，抑制T細胞激酶活性，抑制細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）分泌γ-干擾素（interferon-γ, IFN-γ）等細胞因子，同時也可以抑制NK細胞和B細胞的增殖和功能。有研究[7]觀察到破壞FAP陽性TAF細胞能夠激活機體免疫系統(tǒng)，增加IFN-γ和 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α的釋放，促進效應T細胞活化，因而本研究旨在探討TAF對肺癌細胞免疫檢點抑制分子PD-L1表達的是否有影響。

1 材料及方法

1.1 實驗材料 人肺癌細胞系H1975、H520購于中科院上海細胞庫；人肺癌組織取自已簽署知情同意書患者組織樣本；胎牛血清購于Gibco，DMEM/F12培養(yǎng)基購于Hyclone，胰蛋白酶購于Sigma；流式抗體PD-L1-PE、Mouse Ig G1 K Isotype Control購于ebioscience；Vimrntin、FAPα、CEA、CA125單克隆抗體購于ABCAM；反轉錄試劑盒TRIzol購于Life Technologies；SuperScript? III反轉錄酶購于Life Technologies ；PCR擴增試劑盒購于TaKara；實驗引物來自Quantitech Qiagen；流式細胞儀使用BD LSRII；實時定量PCR使用Bio-Rad iCycler iQ；Transwell小室使用Millicell PISP12R48懸掛式細胞培養(yǎng)皿。

1.2 人肺癌腫瘤相關成纖維細胞培養(yǎng) 分離培養(yǎng)并純化人肺癌相關成纖維細胞：無菌條件下切取肺癌患者手術切除獲得的新鮮肺癌組織標本，去除血塊及脂肪組織，適量II型膠原酶消化成細胞團或單個細胞，終止消化并過200目篩網；轉入無菌離心管中，1,200 rpm離心5 min，棄上清，加入適量含20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，細胞計數后按1×106個/mL接種于無菌培養(yǎng)瓶，37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，此后每2-3天換液1次。待細胞融合度達到85%，進行細胞傳代；自第2次傳代起，根據成纖維細胞與腫瘤細胞生長速度及貼壁能力的差異，應用消化法及反復貼壁法純化細胞，將純化后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每8-10天進行純化、傳代1 次。如此反復至第5代。

消化一皿貼壁生長3 d的細胞，1,000 rpm離心5 min，棄上清，重懸并計數，稀釋細胞濃度至1×106個/mL。以100 μL/接種于24孔板，24 h后使用質量分數4%多聚甲醛固定，膜通透后，用山羊血清封閉30 min，加入特異性一抗波形蛋白（Vimentin）、FAPα，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、糖類抗原125（carbohydrate antigen 125, CA125），4oC孵育過夜，漂洗后加入熒光標記二抗，室溫孵育1 h，隨后DAPI染核10 min，加入抗熒光淬滅封片劑后，顯微鏡下觀察。試驗重復3次。

1.3 肺癌細胞復蘇與傳代 從-80oC冰箱中取出H1975、H520凍存細胞，快速將其置于37oC水浴中解凍，移至含有6 mL完全培養(yǎng)液的15 mL離心管中，1,200 rpm離心5 min。棄上清，6 mL完全培養(yǎng)基重懸，接種到T25培養(yǎng)瓶中，37oC，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天，換用6 mL新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞融合度達到85%，進行細胞傳代。

1.4 共培養(yǎng)體系的建立 取第5代TAF，消化收集制成細胞懸液；分別消化收集傳代第2天的H1975、H520細胞制成細胞懸液。設共培養(yǎng)組為實驗組，肺癌細胞單獨培養(yǎng)組為對照組，培養(yǎng)條件一致。調整TAF細胞密度5×105置于Transwell下室，H1975、H520 3×105置于Transwell上室。24 h細胞貼壁生長，更換上下室培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)。200倍鏡下隨機選取5個視野計數細胞數量。

1.5 流式細胞儀檢測 收集上室實驗組H1975、H520細胞與單獨培養(yǎng)H1975、H520細胞，4oC 1,000 rpm離心5 min。棄上清，重懸并計數，稀釋細胞濃度至1×106個/mL，每組分別取100 μL×2樣本。共培養(yǎng)組設為實驗組，單獨培養(yǎng)組設為對照組，并設置同型對照組。吸取實驗組和對照組100 μL細胞懸液，加入PD-L1-PE抗體2.5 μL，同型對照組加入PE標記鼠IgG1同型抗體，混勻置于4oC避光孵育30 min。2 mL PBS洗滌一次，300 μL PBS重懸，樣本于BD LSRII檢測，各組細胞重復3次。

1.6 RNA提取與實時定量RT-PCR 總RNA提取：收集用于流式檢測剩余細胞1,000 rpm離心5 min，棄上清，溶解于TRIzol試劑，具體操作詳見說明書。

cDNA合成：1 μg總RNA使用SuperScript? III反轉錄酶反轉錄，PCR為20 μL體系iQ SYBR Green Supermix，cDNA 1:100稀釋。

1.7 統(tǒng)計學分析 流式檢測數據分析均于FlowJo 9.8軟件進行，Mann Whitney U檢驗（GraphPad Prism軟件）應用于比較組數據之間的差異。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 檢測分離細胞特定蛋白表達 原代分離肺癌組織樣本，純化、培養(yǎng)5代，免疫熒光染色顯微鏡觀察其具備成纖維細胞相關特性，Vimentin陽性表達（圖1A），同時TAF標志物蛋白FAPα表達陽性（圖1B）；而肺癌相關腫瘤標記物CEA、CA125表達呈陰性（圖1C，圖1D），說明所得細胞為肺癌TAF。

2.2 共培養(yǎng)肺癌細胞生長狀態(tài) 肺癌細胞與TAFs共培養(yǎng)48 h后倒置顯微鏡觀察，實驗組肺癌細胞生長密度高，貼壁良好，無明顯的脫落、壞死，具有肺癌細胞正常的形態(tài)（圖2A，圖2B）。對照組細胞生長密度較實驗組低，可見細胞皺縮而不能貼壁而漂浮于培養(yǎng)液中（圖2C，圖2D）。細胞計數結果，H1975實驗組每100 μm2細胞數為（46±21）個，對照組細胞數為（16±5）個。H520實驗組每100 μm2細胞數為（38±10）個，對照組細胞數為（12±5）個。

2.3 肺癌細胞株H1975、H520 PD-L1蛋白表達率 通過流式細胞儀分析共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)肺癌細胞懸液，H1975細胞PD-L1蛋白表達率，實驗組為（20.93%±3.54%），對照組為（12.58%±2.52%）（P＜0.05），H520細胞PD-L1蛋白表達率，實驗組（19.26%±3.04%），對照組為（11.60%±2.65%）（P＜0.05）。實驗組H1975細胞（圖3A）、H520細胞（圖3C）PD-L1表達水平分別較其單獨培養(yǎng)對照組（圖3B、圖3D）高。

圖 1 檢測分離細胞特定蛋白表達（100×）。TAF標志物Vimentin（A）、FAPα（B）表達呈陽性，肺癌相關標志物CEA（C）、CA125（D）表達呈陰性。Fig 1 Test the specific protein expression of isolated cells (100×). The express of TAF specific proteins Vimentin (A), FAPα (B)were positive, while lung cancer related markers CEA (C), CA125 (D) were negative.FAPα: fibroblast activation protein α; TAF: tumor-associated fibroblasts;CEA: carcinoembryonic antigen; CA125:carbohydrate antigen 125.

圖 2 共培養(yǎng)肺癌細胞生長狀態(tài)。共培養(yǎng)48 h后肺癌細胞（200×）：A：實驗組H1975細胞；B：實驗組H520細胞；C：對照組H1975細胞；D：對照組H520細胞。箭頭位置細胞皺縮不能貼壁而漂浮于培養(yǎng)液中。Fig 2 Lung cancer cells growth after 48 h. After 48 h co-cultured lung cancer cells (200×): A: Co-cultured H1975 cells; B: Co-cultured H520 cells; C: Control H1975 cells; D: Control H520 cells. Arrows: shrunk cells floating in the culture medium.

2.4 RT-PCR 分析人肺癌腫瘤相關成纖維細胞對H1975、H520細胞PD-L1 mRNA表達的影響 如表1所示，H1975細胞PD-L1 mRNA 的表達量實驗組高于對照組（P＜0.05），H520細胞PD-L1 mRNA的表達量實驗組高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞與圍繞在腫瘤細胞周圍的血管、神經、淋巴管以及上皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、纖維細胞，以及生長因子、趨化因子、抗體、激酶等多種小分子物質，一起構成的一個龐大網狀結構，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉移提供條件[8]。而免疫系統(tǒng)則在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，很多免疫缺陷的患者容易發(fā)生惡性腫瘤[9]，接受免疫抑制治療的患者腫瘤的發(fā)生率也高于正常人[10]，其中T細胞介導的免疫應答特別是CD8+CTL發(fā)揮重要作用，而T 細胞的活化受到PD-1/PD-L1信號通路的抑制。目前已知腫瘤微環(huán)境成分之一的TAF可通過多種機制協(xié)助癌細胞擴散，基于PD-L1的免疫抑制作用，本實驗探索TAF是否能促進肺癌細胞PD-L1的表達。

表 1 H1975, H520細胞PD-L1 m RNA表達Ta 1 The PD-L1 m RNA expression in H1975, H520

圖 3 肺癌細胞株H1975、H520 PD-L1蛋白表達率。H1975細胞PD-L1蛋白表達率，共培養(yǎng)組19.14%（A），單獨培養(yǎng)組14.04%（B）；H520細胞PD-L1蛋白表達率，共培養(yǎng)組18.81%（C），單獨培養(yǎng)組12.27%（D）。Fig 3 The PD-L1 protein expression in H1975 and H520. The expression of PD-L1 protein in H1975 is 19.14% in the experiment group (A) and 14.04%in the control group (B). The expression of PD-L1 protein in H520 is 18.81% in the experiment group (C)and 12.72% in the control group (D).

通過人肺癌組織分離TAF并與2種肺癌細胞H7901（人肺腺癌細胞）、H520（人肺鱗癌細胞）非接觸共培養(yǎng)，檢測肺癌細胞PD-L1 mRNA及其蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組肺癌細胞數多于單獨培養(yǎng)組，說明TAF對肺癌細胞的增殖具有促進作用。其次實驗組PD-L1蛋白表達率和mRNA相對表達量相對于單獨培養(yǎng)組均增加，從而在蛋白和基因水平上證實TAF細胞增加肺癌細胞PD-L1的表達。因采用非接觸共培養(yǎng)的模式，我們推斷TAF分泌的某些細胞因子可能在這一過程中起關鍵的作用，具體因子需要在后續(xù)實驗中進一步探索。

腫瘤細胞表達的PD-L1常被作為預后較差的觀測指標[11]，針對PD-L1的單抗藥物治療肺癌已獲得一定療效。本實驗觀察到TAF有助于肺癌細胞PD-L1的表達，因而為治療腫瘤提供了一條新思路：即將表達FAP的TAF作為靶點，阻斷TAF的免疫抑制作用；同時與PD-L1單抗聯(lián)用，在減少PD-1/PD-L1對CTL細胞的耗竭，增加活性CTL細胞的同時使不表達PD-L1蛋白的腫瘤細胞重新被免疫細胞所識別，利用自身的免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞。