王勝民，劉毅，熊華章

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000)

金鐵鎖灌胃對兔膝骨關節(jié)炎的治療作用及其機制探討

王勝民，劉毅，熊華章

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000)

目的 觀察金鐵鎖對兔膝骨關節(jié)炎(OA)的治療作用，并探討其可能機制。方法 120只兔隨機分為4組各30只，模型組、金鐵鎖組、氨基葡萄糖組均制備OA模型，空白組不制備模型；制模后金鐵鎖組和氨基葡萄糖組分別灌胃金鐵鎖、氨基葡萄糖，模型組和空白組給予等量生理鹽水。觀察各組兔膝關節(jié)軟骨大體、病理學變化，比較兔膝關節(jié)軟骨白細胞介素1β(IL-1β)、基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)的mRNA及蛋白。結果 與空白組比較，模型組膝關節(jié)肉眼觀及病理學變化明顯，且隨制模時間變化而變化；與模型組比較，氨基葡萄糖組、金鐵鎖組上述情況好轉，金鐵鎖組治療效果更佳。與空白組比較，模型組IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA及蛋白表達升高；與模型組比較，氨基葡萄糖組、金鐵鎖組IL-1β、MMP-3 mRNA及蛋白表達降低，TIMP-1表達升高；與氨基葡萄糖組比較，金鐵鎖組IL-1β、MMP-3 mRNA及蛋白表達降低，TIMP-1表達升高。結論 金鐵鎖對兔膝OA有治療作用，其機制可能與下調膝炎癥因子IL-1β、MMP-3表達及上調TIMP-1表達有關。

金鐵鎖；中藥；骨關節(jié)炎；白細胞介素1β；基質金屬蛋白酶3；基質金屬蛋白酶抑制劑1

骨關節(jié)炎(OA)是一種以關節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯穆躁P節(jié)疾病[1]，其好發(fā)于60歲以上老人(約66%)，且女性多于男性[2]。近年OA呈高發(fā)病率、高致殘率和病程久的趨勢，給患病人群帶來了巨大的經濟負擔。白細胞介素1β(IL-1β)是OA重要的致炎因子之一，其主要由滑膜及關節(jié)軟骨等產生[3]?；|金屬蛋白酶(MMPs)屬蛋白水解酶類，并主要依靠鋅離子發(fā)揮降解細胞外基質和基底膜的作用[4]。MMPs可以使OA關節(jié)軟骨細胞外基質的合成與降解平衡紊亂并進一步引起關節(jié)軟骨的破壞及變性[5]。IL-1β與其相應受體結合后，可激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，引起MMPs的增高及降解細胞外基質等過程，進而引發(fā)OA[6]。目前，西醫(yī)對OA的治療取得較好效果，但局限于關節(jié)腔注射藥物及手術治療等，且并發(fā)癥較多。中醫(yī)認為OA屬“痹證”范疇，主要病因由肝腎虧損、外感風寒等導致[7]。金鐵鎖屬于石竹科的植物，在貴州等西南地區(qū)居多[8]，主要用于跌打損傷、風濕疼痛，可抑制腫瘤壞死因子-α、IL-1β、氧自由基等，具有抗炎、消腫和鎮(zhèn)痛的作用[9,10]。本研究觀察了金鐵鎖對兔膝OA的治療作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康新西蘭大白兔120只，體質量約2.5～3.0 kg，雌雄不限，兔齡12周，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供；由遵義醫(yī)學院動物實驗基地負責分籠喂養(yǎng)，兔自由飲水，生活環(huán)境溫度(20±2)℃，自然光照與黑暗時間為12 h交替。實驗過程對兔的操作均符合國家科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[11]，且得到了遵義醫(yī)學院倫理委員會的批準。

1.2 主要儀器及試劑 SM2000R型病理組織切片機；ND-1000型核酸蛋白測量儀；CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System；ICyeler iQS型熒光定量PCR儀；DNX-9620A型電腦洗板機；DNM-9602G型酶標分析儀；Centrifuge 5804R型高溫低速離心機。IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒、基質金屬蛋白酶3(MMP-3)ELISA試劑盒、基質金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)ELISA試劑盒；總RNA提取試劑盒；Prime ScriptTMRT Reagent Kit；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ；PCR引物(IL-1β、MMP-3、TIMP-1)。

1.3 金鐵鎖制作 首先揀選、粗碎(20目)的金鐵鎖根莖500 g(產地貴州，檢驗符合藥典規(guī)定)；其次加水提取3次(第1次5倍量水1 h、第2次4倍量水1 h、第3次3倍量水1 h)，濾過合并濾液；再者濃縮(常壓)、收膏、加入淀粉混勻干燥；最后粉碎并加入淀粉補足100 g混勻。

1.4 動物分組、模型制備及金鐵鎖灌胃 120只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組、金鐵鎖組、氨基葡萄糖組各30只，每組再按制模后4、6、8周分3個亞組各10只。除空白組外其余各組均按改良Hulth法制備OA模型[12]。按照兔體質量計算麻醉劑劑量，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(25 mg/kg)，手術區(qū)域常規(guī)備皮并消毒、鋪巾，在兔右膝行內側切口，依次切開皮膚、皮下、筋膜，暴露右膝關節(jié)腔，切除前交叉韌帶及內側半月板并進行前抽屜實驗確保膝關節(jié)的前交叉韌帶已完全斷裂，逐層縫合。各組兔術后予以肌注青霉素鈉20萬U/kg，連用4 d；分籠飼養(yǎng)并每日驅趕兔活動約1 h/d。由于氨基葡萄糖治療膝OA的效果肯定，本實驗中作為陽性藥物對照[13]。模型制備成功的標準參考Mankin評分標準。術后給藥劑量主要根據《藥理實驗方法學》中的人和動物體表面積折算的等效劑量比率表來折算[14]。金鐵鎖組和氨基葡萄糖組分別于制模當日灌胃給予12.8 mg/(kg·d)的金鐵鎖及氨基葡萄糖，空白及模型組灌服等量生理鹽水，總量均為10 mL，1次/d。

1.5 兔及兔膝關節(jié)軟骨肉眼觀察 分別于術后4、6、8周觀察兔的精神狀態(tài)、飲食情況、體質量變化及膝關節(jié)腫脹程度等。

1.6 兔膝關節(jié)軟骨病理學觀察 將實驗動物處死后取右膝股骨內側髁及脛骨平臺內側的負重區(qū)關節(jié)軟骨，生理鹽水沖洗干凈，肉眼觀察后分別放于液氮(-196 ℃)及10%甲醛固定，待測。10%甲醛固定脛骨平臺標本3 d，隨后繼續(xù)用EDTA脫鈣液脫鈣25 d。常規(guī)脫水、剝離脛骨平臺內側負重區(qū)的關節(jié)軟骨、石蠟包埋、行5 μm厚度切片，二甲苯梯度濃度脫蠟，乙醇梯度濃度水化。HE染色：蘇木精染色5 min，鹽酸酒精分化20 s，伊紅染色4 min；番紅染色：番紅染色3 min，二甲苯梯度透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.7 兔膝關節(jié)軟骨IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA檢測 取材同1.6。IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA檢測采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法：①總RNA提?。阂旱h(huán)境下剝離及研磨股骨內側髁負重區(qū)關節(jié)軟骨，嚴格按照試劑盒說明書操作，提取的mRNA稀釋50倍之后用ND1000型核酸蛋白測量儀檢測OD260和OD280。保證OD260/OD280值在1.8～2.0。②cDNA的合成：5×Prime Script Buffer(for Real Time)4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，Total RNA 6 μL，Rnase Free ddH2O 7 μL；總反應體系20 μL，在37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、Forever的條件下嚴格按照說明書操作逆轉錄成cDNA。③基因擴增：以cDNA作為擴增的模板進行RT-PCR檢測，體系：Rnase Free ddH2O 6.4 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物(Sangon Biotech合成，詳見表1)各0.8 μL，總體積20.0 μL；擴增條件：95 ℃預變性30 s，1循環(huán)；95 ℃變性10 s，40個循環(huán)；退火延伸60 ℃、30 s，40個循環(huán)；溶解55～95 ℃，5 s。用2-ΔΔCt法(Ct為熒光達到閾值時所需PCR的循環(huán)數)分析IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA相對表達量。

表1 RT-PCR目的基因引物的序列及產物的長度

1.8 兔血漿IL-1β、MMP-3、TIMP-1蛋白檢測 分別在制模4、6、8周分別取兔耳緣靜脈取血(2 mL)，并裝于乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝管，將抗凝管上下顛倒混勻3次，靜置后在離心機上以3 000 r/min離心20 min，分離血漿后裝在Eppendorf中，-80 ℃保存，待測。IL-1β、MMP-3、TIMP-1蛋白檢測采用ELISA法：在相應反應板孔內加入100 μL標準液和100 μL血漿；充分混勻30 s，蓋好反應板孔，在37 ℃環(huán)境下溫育約60 min。洗板：甩盡反應板內液體，反應板反復用洗滌液洗滌，反復拍打，重復5次。每孔加入100 μL 1×Biotin，輕輕搖勻30 s，封住反應板孔，37 ℃溫育60 min；再次洗板。每孔加入100 μL 1×HRP，輕輕混勻30 s，封住板孔，37 ℃溫育60 min；再次洗板。每反應孔加入100 μL的TMB顯色液，混勻10 s，在37 ℃的暗處環(huán)境內溫育25 min。每反應孔內加入100 μL的反應終止液，混勻30 s，在30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光度值。繪制標準曲線，以標準品濃度的對數作為橫坐標，用OD值作為縱坐標，計算相應檢測指標蛋白濃度。

2 結果

2.1 各組兔膝關節(jié)軟骨肉眼觀及病理學變化 ①肉眼觀：空白組兔活動自如，毛發(fā)光亮，右膝關節(jié)無腫大；制模4、6、8周前后體質量無明顯增減，關節(jié)軟骨透明，表面光滑、平整，色澤鮮亮，無骨贅形成。模型組兔制模后4、6、8周的活動逐漸受限，右膝關節(jié)腫脹程度隨時間的延長而加重；6周時兔體質量開始出現(xiàn)明顯減輕，右膝開始明顯腫脹，出現(xiàn)跛行，毛發(fā)暗淡；8周時兔跛行明顯，關節(jié)軟骨表面可見潰瘍，可見明顯骨贅及部分骨外露。氨基葡萄糖組兔活動隨時間延長而減少，膝關節(jié)腫脹程度隨時間增加而加重；制模6周時，體質量開始減輕，右膝開始腫脹，出現(xiàn)跛行，毛發(fā)暗淡；制模8周時，跛行較前加重，關節(jié)軟骨局部可見輕度潰瘍，可見少量骨贅。金鐵鎖組制模后4周時，兔活動、關節(jié)腫脹情況與模型組比較，均無明顯差別，體質量未見明顯增減，關節(jié)軟骨表面稍粗糙，有小的裂隙，無明顯骨贅形成，色澤暗淡；制模后6、8周時，兔活動較之前明顯減少，關節(jié)腫脹情況較之前加重，但均比模型組明顯改善，體質量減輕不明顯，可見跛行。②病理學：制模后空白組兔關節(jié)軟骨透明，表面結構規(guī)則、正常；細胞數量正常，基質染色正常，潮線完整。模型組兔制模后4周時關節(jié)軟骨表面粗糙，可見較多不規(guī)則裂隙形成，細胞數量彌漫性增多，基質染色輕度減少，潮線完整；6周時關節(jié)軟骨表面較粗糙、不規(guī)則，可見局部關節(jié)軟骨血管翳形成，軟骨細胞出現(xiàn)大量簇集樣細胞團，基質染色輕中度失染，局部潮線不完整；8周時關節(jié)軟骨表面粗糙、極不規(guī)則，可見裂隙深達關節(jié)軟骨的鈣化層；軟骨細胞的數量明顯減少，基質中度或重度失染，潮線不完整。氨基葡萄糖組制模后4周關節(jié)軟骨表面粗糙，結構欠規(guī)則，可見不規(guī)則裂隙形成，軟骨細胞的數量彌漫性增多，基質染色輕度減少，潮線完整；6周時關節(jié)軟骨表面較粗糙，可見部分軟骨血管翳形成，細胞數量出現(xiàn)簇集樣細胞團，基質染色輕中度失染，局部潮線不完整；8周時關節(jié)軟骨表面粗糙、結構不規(guī)則，可見較多軟骨血管翳形成，甚至裂隙深達關節(jié)軟骨的放射層，軟骨細胞的數量輕中度減少，基質中度或重度失染，潮線不完整。金鐵鎖組兔制模4周時關節(jié)軟骨表面稍粗糙，局部可見少量不規(guī)則裂隙形成，細胞的數量正常，基質染色輕度減少，潮線完整；6周時關節(jié)軟骨表面粗糙、不規(guī)則，可見較多不規(guī)則裂隙，細胞數量彌漫性增多，基質染色輕中度失染，局部潮線不完整；8周時關節(jié)軟骨表面較粗糙、不規(guī)則，可見部分關節(jié)軟骨血管翳形成，甚至裂隙深達關節(jié)軟骨的過渡層，細胞的數量輕度減少，基質中度或重度失染，潮線不完整。

2.2 各組兔膝關節(jié)軟骨IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA比較 結果見表2。

表2 各組兔膝關節(jié)軟骨IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA表達量比較

與同組4周比較，*P<0.05；與同組6周比較，□P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與金鐵鎖組比較，○P<0.05；與空白組比較，☆P<0.05。

2.3 各組兔血漿IL-1β、MMP-3、TIMP-1蛋白比較 結果見表3。

表3 各組兔膝血漿IL-1β、MMP-3、TIMP-1蛋白水平比較

注：與同組4周比較，*P<0.05；與同組6周比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與金鐵鎖組比較，○P<0.05；與空白組比較，□P<0.05。

3 討論

OA已經被世界衛(wèi)生組織視為危害人類健康的“三大殺手”之一，給社會和家庭及個人帶來了巨大的傷害。OA好發(fā)于中老年人，多表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、腫脹、畸形等，癥狀較輕者可口服藥物及關節(jié)腔注射玻璃酸鈉，嚴重者只能行人工全膝關節(jié)置換術[15]。成功構建膝OA動物模型是研究OA藥物治療、發(fā)病機制等的前提條件。現(xiàn)有OA動物模型主要包括自發(fā)性和誘發(fā)性動物模型，最常用手術制模方法為改良Hulth法[16]，主要是通過切斷膝關節(jié)的前交叉韌帶和內側半月板以引起膝關節(jié)不穩(wěn)及應力改變等，進一步構建膝OA的動物模型。

目前OA發(fā)病機制不明確，其中一種觀點考慮為細胞因子所致。在OA形成過程中，關節(jié)軟骨細胞及滑膜等均可產生大量細胞因子破壞關節(jié)軟骨。IL-1β是由多種細胞分泌的細胞因子，主要參與細胞的免疫應答和介導炎癥反應及調節(jié)細胞的生理功能等[17]。IL-1β是OA發(fā)病過程中的重要炎癥因子之一，可通過一系列級聯(lián)反應引起關節(jié)的破壞和炎癥反應等，主要通過改變軟骨細胞正常結構與功能，調節(jié)蛋白水解酶的合成與分泌，加速膠原蛋白及聚蛋白多糖的降解，進而誘發(fā)OA[18]。OA的發(fā)生、發(fā)展與諸多細胞信號通路也存在著密切的關系，其中MAPK信號通路是一組能被不同的細胞外刺激(如細胞因子、細胞應激)激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶[19]。MAPK級聯(lián)激活是多種細胞信號通路的中心，在沒有受到信號刺激的細胞中，MAPK處于靜止狀態(tài)；然而當細胞受到細胞因子(如IL-1β)等刺激時，MAPK接收MAPK激酶(MKK)和MAPK激酶激酶(MKKK)的活化信號而被激活，表現(xiàn)為逐級磷酸化的過程[20]。而MAPK細胞信號通路中的P38途徑也是導致OA發(fā)生的重要因素之一。研究[21]表明IL-β可通過激活P38信號通路進一步誘導MMP-13的表達，降解關節(jié)軟骨細胞外基質最后誘發(fā)OA。因此，研究阻斷P38信號通路的方法是防止OA軟骨退變的重要方向。MMP是一種具有鋅與鈣依賴性并在結構上擁有高度同源性的內肽酶家族，主要參與細胞外基質膠原、蛋白多糖等成分的降解[22]。Jacques等[23]發(fā)現(xiàn)MMP-1、MMP-3、MMP-13等與OA病情的發(fā)生及發(fā)展有關。MMP-3對關節(jié)軟骨基質中的蛋白多糖具有高度的裂解活性，并可加速Ⅱ型膠原的降解，還能激活MMP-1、MMP-9等與OA相關的炎癥分子，引起一系列的級聯(lián)效應，從而加速OA的病程進展[24，25]。TIMP-1是MMP-3的特異性抑制劑，與MMP-3結合成1∶1的復合物，抑制MMP-3的活性及血管增殖，正常情況下兩者保持平衡[26]；如果失去相對平衡則關節(jié)軟骨基質中蛋白分解酶的活性增高，則引起關節(jié)軟骨的破壞，從而引發(fā)OA[27]。因此，通過調節(jié)MMP-3與TIMP-1之間平衡也是防治OA的重要研究方向之一。

金鐵鎖，別名獨定子、百步穿楊等，《滇南本草》最先記錄。研究[28]表明,金鐵鎖具有很高的藥用和經濟價值；三萜、三萜皂苷、環(huán)肽等為中藥金鐵鎖的主要化學成分，此外還有氨基酸和有機酸等[29]。金鐵鎖入藥的主要部位為地下根，氣體微弱，味辛、麻，有刺喉感。金鐵鎖具有止痛、散瘀和消癰排膿等療效[30]。近年來，隨著各項研究的逐步深入，苗藥金鐵鎖作為一種傳統(tǒng)的民間藥物被逐漸重視。目前，對金鐵鎖的研究主要集中在化學成分、植物特性等方面，而其對OA及類風濕性關節(jié)炎等作用的相關研究較少。本課題的切入點主要是針對目前OA無明確的療效藥物入手，再者中醫(yī)藥逐漸被重視，據此進行的深入研究。

與空白組比較，模型組膝關節(jié)肉眼觀及病理學變化明顯，且隨制模時間變化而變化；與模型組比較，氨基葡萄糖組、金鐵鎖組上述情況好轉，金鐵鎖組治療效果更佳。與空白組比較，模型組IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA及蛋白表達升高；與模型組比較，氨基葡萄糖組、金鐵鎖組IL-1β、MMP-3 mRNA及蛋白表達降低，TIMP-1表達升高；與氨基葡萄糖組比較，金鐵鎖組IL-1β、MMP-3 mRNA及蛋白表達降低，TIMP-1表達升高。提示金鐵鎖對兔膝OA有治療作用，其機制可能與下調IL-1β、MMP-3表達及上調TIMP-1表達有關。

[1] Hui W, Young DA, Rowan AD, et al. Oxidative changes and signalling pathways are pivotal in initiating agerelated changes in articular cartilage [J]. Ann Rheum Dis, 2016,75(2):449-458.

[2] Visser AW, De Mutsert R, Le CS, et al. The relative contribution of mechanical stress and systemic processes in different types of osteoarthritis: the NEO study [J]. Ann Rheum Dis, 2015,74(10):1842-1847.

[3] Blasioli DJ, Kaplan DL. The roles of catabolic factors in the development of osteoarthritis[J]. Tissue Eng Part B Rev, 2014,20(4):355-363.

[4] Li ZC, Han N, Li X, et al. Decreased expression of microRNA-130a correlates with TNF-α in the development of osteoarthritis[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(3):2555-2564.

[5] Zhen G, Cao X. Targeting TGFβ signaling in subchondral bone and articular cartilage homeostasis[J]. Trends Pharmacol Sci, 2014,35(5):227-236.

[6] Papathanasiou I, Michalitsis S, Hantes ME, et al.Molecular changes indicative of cartilage degeneration and osteoarthritis development in patients with anterior cruciate ligament injury[J]. BMC Musculoskelet Disord, 2016,17(21):1-10.

[7] 徐衛(wèi)平,王小軍.中藥治療骨關節(jié)炎的現(xiàn)狀分析[J].科技展望,2017,27(5):304.

[8] 沈放,馬銀海,楊黎江,等.野生和栽培金鐵鎖鎮(zhèn)痛功效及有效部位的比較[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(18):240-243.

[9] 趙保勝,桂海水,朱寅荻,等.金鐵鎖化學成分、藥理作用和臨床應用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(18):298-301.

[10] 王勝民,劉毅,劉曉麗,等.金鐵鎖對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎兔關節(jié)軟骨的保護作用及其機制[J].山東醫(yī)藥,2016,56(16):27-29.

[11] 程津津,任萍萍.學習《關于善待實驗動物的指導性意見》后的體會[J].實驗動物科學,2011,28(3):78-79.

[12] Hulth A, Lindberg L, Telhag H. Experimental osteoarthritis in rabbits. Preliminary report [J]. Acta Orthop Scand, 1970,41(5):522-530.

[13] 陳剛,毛云鶴,李箭.氨基葡萄糖治療骨關節(jié)炎的臨床應用進展[J].華西醫(yī)學,2016,31(7):1161-1163.

[14] 魏偉,吳希美,李元建.藥理實驗方法學[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:69-73.

[15] Sampiero T, Cardoso J, Bush R, et al. Association of socioeconomic factors with pain and function in older adults with knee osteoarthritis[J]. J Pain, 2016,17(4S):S28.

[16] Araki S, Imai S, Ishigaki H, et al. Improved quality of cartilagerepair by bone marrow mesenchymal stem cells fortreatment of an osteochondral defect in a cynomolgus macaquemodel[J]. Acta Orthop, 2015,86(1):119-126.

[17] Assis L, Milares LP, Almeida T, et al. Aerobic exercise training and low-level laser therapy modulate inflammatory response and degenerative process in an experimental model of knee osteoarthritis in rats[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2016,24(1):169-177.

[18] Park JS, Kim DK, Shin HD, et al. Apigenin regulates interleukin-1β-induced production of matrix metalloproteinase both in the knee joint of rat and in primary cultured articular chondrocytes[J]. Biomol Ther(Seoul), 2016,24(2):163-170.

[19] Crittenden PL, Filipov NM. Manganese modulation of MAPK pathways: effects on upstream mitogen activated protein kinase kinases and mitogen activated kinase phosphatase-1 in microglial cells[J]. J Appl Toxicol, 2011,31(1):1-10.

[20] Sánchez Y, Amrán D, Fernández C, et al. Genistein selectively potentiates arsenic trioxide-induced apoptosis in human leukemia cells via reactive oxygen species generation and activation of reactive oxygen species-inducible protein kinases(p38-MAPK, AMPK) [J]. Int J Cancer, 2008,123(5):1205-1214.

[21] Kjellerup RB, Kragballe K, Iversen L, et al. Pro-inflammatory cytokine release in keratinocytes is mediated through the MAPK signal-integrating kinases[J]. Exp Dermatol, 2008,17(6):498-504.

[22] Ji JB, Li XF, Liu L, et al. Effect of low intensity pulsed ultrasound on expression of TIMP-2 in serum and expression of mmp-13 in articular cartilage of rabbits with knee osteoarthritis [J]. Asian Pac J Trop Med, 2015,8(12):1043-1048.

[23] Jacques L, Bernard N, Alexandre P, et al. Genetic polymorphisms of MMP-1, MMP-3 and MMP-7 gene promoter and risk of colorectal adenoma[J]. BMC Cancer, 2006,6(1):1-8.

[24] Chu XQ, Wang JJ, Dou LD, et al. Cartilage oligomeric matrix protein and matrix metalloproteinase-3 expression in the serum and joint fluid of a reversible osteoarthritis rabbit model[J]. Genet Mol Res, 2015,14(4):14207-14215.

[25] Bassiouni HM, El-Deeb M, Kenawy N, et al. Phonoarthrography, musculoskeletal ultrasonography, and biochemical biomarkers for the evaluation of knee cartilage in osteoarthritis[J]. Mod Rheumatol, 2011,21(5):500-508.

[26] Szymanowski K, Mikolajczyk M, Wirstlein P, et al. Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9, tissue inhibitor of matrix metalloproteinases (TIMP-1) and transforming growth factor-β2 (TGF-β2) expression in eutopic endometrium of women with peritoneal endometriosis[J]. Ann Agric Environ Med, 2016,23(4):649-653.

[27] Alameddine HS, Morgan JE. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in inflammation and fibrosis of skeletal muscles[J]. J Neuromuscul Dis, 2016,3(4):455-473.

[28] Huang MJ, Huang HQ, Salam N, et al. Nocardioides intraradicalis sp. nov., isolated from the roots of Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2016,66(10):3841-3847.

[29] Zhou X, Wang L,Tian Y,et al. Chemical constituents from roots of psammosilene tunicoides[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2013,38(20):3507-3509.

[30] Wang L, Gong XJ, Zhou X, et al. Chemical constituents of psammosilene tunicoides and bacteriostatic activity[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2012,37(23):3577-3580.

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《山東醫(yī)藥》關于摘要與關鍵詞的說明

論著需附中、英文摘要(包括目的、方法、結果、結論四部分)。中文摘要300～500字，英文摘要400～500個實詞。英文摘要尚應包括文題、作者姓名(漢語拼音)。論著、基礎研究、臨床研究、綜述與講座需標引關鍵詞2～5個，盡量使用美國國立醫(yī)學圖書館編輯的最新版《Index Medicus》中醫(yī)學主題詞表(MeSH)所列的詞。英文關鍵詞中的縮寫詞應按MeSH還原為全稱。

貴州省中醫(yī)藥管理局資助項目(QYZZ-2016-029)。

劉毅(E-mail: 13308529536@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.010

R684.3

A

1002-266X(2017)31-0036-05

2017-07-02)