何櫻，黃維甄，歐陽考濱，袁霞

(惠州市中心人民醫(yī)院，廣東惠州 516000)

結(jié)直腸癌患者糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化狀態(tài)觀察

何櫻，黃維甄，歐陽考濱，袁霞

(惠州市中心人民醫(yī)院，廣東惠州 516000)

目的 觀察結(jié)直腸癌(CRC)患者糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化狀態(tài)。方法 CRC患者50例(腫瘤組)、結(jié)直腸良性病變者50例(良性組)、健康體檢者50例(正常組)，采用甲基化特異度PCR的方法檢測各組糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化檢出率，并分析其與CRC臨床病理參數(shù)的關系。根據(jù)腸鏡病理診斷結(jié)果進行驗證，比較糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A單獨及聯(lián)合檢測診斷CRC的敏感度和特異度。結(jié)果 腫瘤組、良性組、正常組糞便p16INK4a基因甲基化檢出率分別為74%、28%、14%，MGMT基因甲基化檢出率分別為56%、24%、12%，RASSF1A基因甲基化檢出率分別為72%、20%、10%，腫瘤組分別與正常組、良性組比較，P均<0.05。p16INK4a基因甲基化狀態(tài)與CRC分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，MGMT基因甲基化狀態(tài)與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，RASSF1A基因甲基化狀態(tài)與CRC分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，P均<0.05。三者聯(lián)合檢測診斷CRC的敏感度為95.8%，特異度為83.4%，ROC曲線下面積為0.816(95%CI0.739%～0.894%)。結(jié)論 CRC患者糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化檢出率明顯高于結(jié)直腸良性病變者及健康體檢者，聯(lián)合檢測上述指標有助于CRC患者的早期診斷及其生物學行為的判斷。

結(jié)直腸癌；p16INK4a基因；MGMT基因；RASSF1A基因；基因甲基化

結(jié)直腸癌(CRC)是常見的惡性消化道腫瘤之一，有較高的發(fā)病率及病死率[1,2]。CRC早期未發(fā)生癌組織轉(zhuǎn)移時患者5年生存率為90%，發(fā)生局部轉(zhuǎn)移時患者生存率為68%，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移時患者生存率僅為10%[3～5]。早發(fā)現(xiàn)及早治療能明顯提高CRC患者的生存率[6]，近年發(fā)達國家的CRC患者5年生存率有所提高[7]。近年來，腫瘤的表觀遺傳學研究進展對CRC的診斷和治療具有深遠的意義[8,9]。有研究[10,11]表明，抑癌基因啟動子區(qū)高度甲基化是抑癌基因失活的一個至關重要的機制。研究[12]發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中均存在多個抑癌基因啟動子甲基化水平明顯升高，提示抑癌基因啟動子甲基化水平能作為CRC診斷的分子標志物。自腫瘤組織中脫落的癌細胞及游離的DNA能穩(wěn)定存在于CRC患者的糞便，因此提取糞便DNA、檢查抑癌基因啟動子甲基化水平能為CRC篩查提供新的可能[7]。本研究采用甲基化特異度PCR(MSP)技術檢測CRC患者糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因的甲基化狀態(tài)，并探討其對CRC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年10月～2015年10月惠州市中心人民醫(yī)院收治的CRC患者50例(腫瘤組)，男26例，女24例；年齡65～72歲，中位年齡68.5歲。良性結(jié)直腸疾病患者50例(良性組)，男29例，女21例；年齡65～73歲，中位年齡69歲。健康體檢者50例(正常組)，男23例，女27例；年齡65～71歲，中位年齡68歲。納入標準：①CRC患者：年齡>65歲，腸鏡下有陽性發(fā)現(xiàn)且病理活檢證實為癌，包括腺癌、印戒細胞癌、類癌等；②良性結(jié)直腸疾病患者：年齡>65歲，腸鏡下有除痔瘡外的陽性發(fā)現(xiàn)，病理檢查排除癌，包括腺瘤型息肉、增生性息肉等；③健康體檢者：年齡>65歲，腸鏡下除痔瘡外，無異常發(fā)現(xiàn)者。排除標準：①有其他消化道惡性腫瘤病史；②具有心功能不全、嚴重心律不齊、精神異常等基礎疾病，不能耐受、不愿意配合或接受結(jié)直腸鏡檢查者。

1.2 糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化狀態(tài)觀察 ①DNA抽提和PCR擴增：稱取所有入選對象糞便標本200 g左右，根據(jù)QIAamp糞便DNA試劑盒說明書提取基因組DNA，用100 μL去離子水洗脫DNA，并用NanoDrop ND1000分光光度計檢測DNA。利用普通PCR擴增管家基因β-actin，確定抽提的糞便DNA中人體基因組的質(zhì)量及含量，引物序列見表1。PCR反應體系：上下游引物各1 μL，模板3 μL，Taq酶12.5 μL，加水補足至總體積25 μL。反應條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，63 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個循環(huán)，72 ℃、5 min。最后取10 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；取擴增成功的標本進行進一步甲基化修飾。②DNA修飾：取成功擴增管家基因的糞便DNA 1.5～2.0 μg，嚴格按照EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)說明書進行亞硫酸鹽修飾并回收。通過亞硫酸鹽修飾后，糞便DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)將轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而甲基化修飾的胞嘧啶則保持不變，用50 μL的去離子水重新溶解修飾后的DNA樣品，用于后續(xù)的MSP檢測。③MSP檢測：采用MSP技術檢測CRC患者糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化狀態(tài)。設計甲基化特異度PCR及普通PCR引物(見表1)。反應總體積為25 μL：TaKaRa Taq EX Hot Star Version(5 U/μL)0.25 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 M)2 μL，PrimerF 0.5 μL(10 μmol/mL)，PrimerR 0.5 μL(10 μmol/mL)，模板DNA 2 μL，蒸餾水17 μL。反應條件為：95 ℃、12 min，94 ℃、30 s，61 ℃(甲基化，M)/59 ℃(非甲基化，U)30 s，72 ℃、30 s，共35個循環(huán)，72 ℃、5 min。取15 μL反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因的引物序列、

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。不同組間p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因啟動子甲基化檢出率比較采用χ2檢驗，采用ROC曲線評估p16INK4a、MGMT、RASSF1A及3者聯(lián)合對CRC的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化檢出率比較 腫瘤組、良性組、正常組p16INK4a基因甲基化檢出率分別為74%(37/50)、28%(14/50)、14%(7/50)，MGMT基因甲基化檢出率分別為56%(28/50)、24%(12/50)、12%(6/50)，RASSF1A基因甲基化檢出率分別為72%(36/50)、20%(10/50)、10%(5/50)，腫瘤組分別與正常組、良性組比較，P均<0.05。

2.2 糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化狀態(tài)與CRC臨床病理參數(shù)的相關性 結(jié)果見表2。由表2可知，糞便p16INK4a基因甲基化與CRC分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P均<0.05)，而與性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、腫瘤部位無關(P均>0.05)；MGMT基因甲基化與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P均<0.05)，而與性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、分化程度、腫瘤部位、TNM分期無關(P均>0.05)；RASSF1A基因甲基化與CRC分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P均<0.05)，而與性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、腫瘤部位無關(P均>0.05)。

表2 糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化與CRC臨床病理參數(shù)的相關性(例)

2.3 p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化檢測診斷CRC的敏感度、特異度、ROC曲線下面積 p16INK4a基因甲基化診斷CRC的敏感度為64%，特異度為86%，ROC曲線下面積為0.765(95%CI0.681%～0.849%)；MGMT基因的敏感度為61%，特異度為79%，ROC曲線下面積為0.795(95%CI0.596%～0.784%)；RASSF1A基因的敏感度為70%，特異度為86%，ROC曲線下面積為0.795(95%CI0.713%～0.877%)；三者聯(lián)合檢測的敏感度為95.8%，特異度為83.4%，ROC曲線下面積為0.816(95%CI0.739%～0.894%)。

3 討論

早期CRC患者多數(shù)能接受手術治療，且預后較好[13]，而晚期CRC多數(shù)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，無法接受手術治療，多需接受放化療等保守治療，預后較差[14]。對于早期癌變階段的CRC患者進行手術治療，術后5年生存率有望超過90%；而針對晚期患者，其5年生存率不足10%[15]。目前，我國年齡>50歲的老齡人口多達2.56億，而具有CRC風險的人群超過1億[16]。故對高齡人群進行大規(guī)模、全面結(jié)腸癌篩查，對于CRC的早期診斷、早期治療，提高CRC患者的預后具有至關重要的作用。

癌胚抗原、潛血試驗(FOBT)、鋇劑灌腸、結(jié)直腸鏡檢查等是目前CRC的主要篩查手段，其中用于普查篩選的手段主要是糞便檢查及影像學檢查[17]。FOBT作為CRC的常規(guī)篩查手段，其具有簡單方便及患者易接受等特點，但是其對CRC的診斷靈敏感度低、假陽性率高[18]。而結(jié)腸鏡檢查是侵入性檢查，具有檢查方式繁瑣、耗時長、易引起并發(fā)癥等特點，若作為常規(guī)普查方式，患者不易接受[19]。FOBT及結(jié)腸鏡檢查均不是作為CRC大規(guī)模篩查的有效手段。因此，尋找一種簡單、敏感度及特異度高的CRC高危人群初篩指標，根據(jù)初篩結(jié)果對陽性人群采用結(jié)腸鏡檢查，這種CRC篩查方法避免了盲目大規(guī)模結(jié)腸鏡篩查帶來的弊端和可行性較差等缺點，同時也節(jié)約資源，提高了結(jié)直腸鏡檢查陽性率。大量證據(jù)表明，大量從結(jié)腸癌中脫落的CRC細胞能穩(wěn)定存在于糞便，因此可以通過提取人群糞便DNA，檢測腫瘤異常表達分子作為CRC篩查的分子標志物。

近年研究[17]表明，抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的高度甲基化是抑癌基因失活的一個重要分子機制。不同抑癌基因的轉(zhuǎn)錄失活可導致不同后果，包括細胞周期、細胞凋亡、細胞黏附、DNA修復等。在CRC中有多個抑癌基因啟動子區(qū)CpG島呈現(xiàn)不同程度甲基化，從而導致基因轉(zhuǎn)錄沉默。p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因DNA甲基化在大部分CRC患者腫瘤細胞中都能檢測到，且基因啟動子甲基化檢測相對容易。本研究發(fā)現(xiàn)，健康體檢者、結(jié)直腸良性病變者、CRC患者糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化檢出率呈遞增趨勢，提示從正常、良性病變到CRC，p16INK4a、MGMT、RASSF1A甲基化水平逐漸提高。相關性分析表明，糞便p16INK4a、RASSF1A甲基化均與CRC患者的腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，而MGMT甲基化與CRC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，這在一定程度上提示p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化與CRC進展相關，對CRC患者的預后判斷具有一定價值。本文結(jié)果還顯示，p16INK4a、MGMT、RASSF1A單獨檢測診斷CRC的敏感度分別為64%、61%、70%，特異度為86%、79%、86%，RASSF1A的敏感度、特異度均較高，而p16INK4a和MGMT特異度較高、敏感度較低；而3者聯(lián)合檢測能明顯提高CRC的診斷效能。上述結(jié)果提示，檢測糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因有助于CRC患者的篩查，其作為一種無創(chuàng)的檢測方法，在臨床診斷中具有潛在價值，有望成為新型的輔助篩查CRC的分子標志物。

由于本研究的總樣本數(shù)量有限，我們需擴大樣本量以進一步驗證本研究結(jié)果。同時，本研究年限較短，目前暫無糞便p16INK4a、MGMT、RASSF1A甲基化狀態(tài)與CRC患者預后的關系，我們需跟蹤本研究所納入患者的5年生存率及10年生存率，定期收集本研究納入患者的糞便標本，進一步探討p16INK4a、MGMT、RASSF1A甲基化對CRC患者預后判斷的臨床價值和意義。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012 [J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Siegel RL, Miller KD, Fedewa SA, et al. Colorectal cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017,67(3):177-193.

[3] 何櫻,黃維甄,歐陽考濱,等.聯(lián)合檢測糞便ECAD基因甲基化和隱血在結(jié)直腸癌診斷中的價值[J].廣東醫(yī)學,2016,37(23):3531-3534.

[4] Labianca R, Nordlinger B, Beretta GD, et al. Early colon cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up [J]. Annal Oncol, 2013,24(Suppl6):64-72.

[5] O′Connell JB, Maggard MA, Ko CY. Colon cancer survival rates with the new American joint committee on cancer sixth edition staging [J]. J Natl Cancer, 2004,96(19):1420-1425.

[6] Simon K. Colorectal cancer development and advances in screening [J]. Clin Interv Aging, 2016,11(1):967-976.

[7] Janz T, Lu K, Povlow MR, et al. A review of colorectal cancer detection modalities, stool DNA, and fecal immunochemistry testing in adults over the age of 50[J]. Cureus, 2016,8(12):931.

[8] Sahnane N, Magnoli F, Bernasconi B, et al. Aberrant DNA methylation profiles of inherited and sporadic colorectal cancer [J]. Clin Epigenetics, 2015,7(1):131.

[9] Baharudin R, Ab Mutalib NS, Othman SN, et al. Identification of predictive dna methylation biomarkers for chemotherapy response in colorectal cancer[J]. Front Pharmacol, 2017,8(1):47.

[10] Ma Y, Chen Y, Petersen I. Expression and promoter DNA methylation of MLH1 in colorectal cancer and lung cancer[J]. Pathol Res Pract, 2017,213(4):333-338.

[11] Durso DF, Bacalini MG, do Valle IF, et al. Aberrant methylation patterns in colorectal cancer: a meta-analysis[J]. Oncotarget, 2017,8(8):12820-12830.

[12] Zamani M, Hosseini SV, Mokarram P. Epigenetic biomarkers in colorectal cancer: premises and prospects[J]. Biomarkers, 2016,10(1):1-10.

[13] 王磊,劉志華,汪建平.我國結(jié)直腸癌的診療現(xiàn)狀[J].中華實驗外科學,2015,32(4):677-679.

[14] 陳力,詹成,王琳,等.30例結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移患者的臨床特征及預后分析[J].復旦學報,2015,42(4):524-527.

[15] 黃天驕,史學森.血液microRNA對診斷早期結(jié)直腸癌的價值[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學雜志,2016,48(8):944-948.

[16] Yee YK, Tan VP, Chan P, et al. Epidemiology of colorectal cancer in Asia [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2009,24(12):1810-1816.

[17] 王裴,張明鑫,張超,等.糞便DNA甲基化檢測在結(jié)直腸癌早期診斷中的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2015,23(6):874-880.

[18] 張學松,張謝,黃詩良,等.GATA5甲基化在結(jié)直腸癌血漿和糞便中的檢測及臨床診斷價值[J].中國癌癥雜志,2014,24(7):501-506.

[19] 樂有林,趙己未,孫嫣,等.糞便DNA中MGMT、XAF1基因啟動子甲基化聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌篩查中的應用研究[J].胃腸病學和肝病學雜志,2014,23(3):315-318.

Observation of p16INK4a, MGMT, and RASSF1A gene methylation in stool of patients with colorectal cancer

HEYing,HUANGWeizhen,OUYANGKaobin,YUANXia

(HuizhouMunicipalCentralHospitalofGuangdongProvince,Huizhou516000,China)

Objective To observe the gene promoter methylation of p16INK4a, MGMT, and RASSF1A in stool of patients with colorectal cancer (CRC). Methods Fifty healthy examined people (control group), 50 patients with benign colorectal disease (benign colorectal disease group) and 50 CRC patients (CRC group) were enrolled in the study. The p16INK4a, MGMT and RASSF1A promoter methylation detection rates in stool were detected by metilylation specific PCR (MSP). The correlation between p16INK4a, MGMT and RASSF1A promoter methylation levels and clinical parameters were analyzed by using statistic method. The sensitivity and specificity of p16INK4a, MGMT, and RASSF1A alone and in combination for the diagnosis of CRC were compared by using Bay's equation on the basis of pathological diagnosis.Results The detection rates for p16INK4a methylation were 74%, 28%, and 14% in the CRC group, benign colorectal disease group, and control group, 56%, 24%, and 12% for MGMT gene, and 72%, 20%, and 10% for RASSF1A gene, respectively. Statistically significant difference was found between the control group, benign colorectal disease group, and CRC group (allP<0.05). Additionally, correlation analysis showed that both p16INK4a and RASSF1A gene methylation was significantly associated with differentiated degree of CRC, TNM stage, and lymph node metastasis, while MGMT was correlated with lymph node metastasis (allP<0.05). The diagnostic sensitivity and specificity for combination of p16INK4a, MGMT, and RASSF1A was 95.8% and 83.4%, respectively. The ROC area under curve was 0.816 (95%CI: 0.739%-0.894%). Conclusions The methylation levels of p16INK4a, MGMT and RASSF1A in stool from CRC patients are significantly higher than those of patients with benign colorectal disease and healthy people. The combined detection of these three genes in stool is useful for early diagnosis of CRC and prediction of biological function of CRC.

colorectal carcinoma; p16INK4a gene; MGMT gene; RASSF1A gene; gene methylation

廣東省惠州市民政局資助項目(20151116344)。

何櫻(1978-)，女，副主任醫(yī)師，主要研究方向為結(jié)直腸癌化療的基礎及臨床。E-mail： 13928311788@163.com

袁霞(1971-)，女，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要研究方向為惡性腫瘤的化學治療、內(nèi)分泌治療、生物治療、分子靶向治療等。E-mail: yuanxia71@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.003

R735.3

A

1002-266X(2017)31-0009-04

2017-04-03)