李瑞，寧楊，田訓(xùn)，李莉，王玉蘭，曾珍，龔丹妮，黃磊，李賀梅，張慶華

(華中科技大學(xué)附屬武漢中心醫(yī)院，武漢 430014)

·基礎(chǔ)研究·

轉(zhuǎn)化生長因子-β對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3活性氧簇表達(dá)的影響及其機(jī)制

李瑞，寧楊，田訓(xùn)，李莉，王玉蘭，曾珍，龔丹妮，黃磊，李賀梅，張慶華

(華中科技大學(xué)附屬武漢中心醫(yī)院，武漢 430014)

目的 觀察轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制。方法 取對(duì)數(shù)生長期SK-OV-3細(xì)胞，隨機(jī)分為兩組，觀察組用2 mL培養(yǎng)液+2 μL無血清DMEM配制的5 μg/mL TGF-β培養(yǎng)(最終濃度為5 ng/mL)，對(duì)照組直接加2 mL培養(yǎng)液。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總的活性氧簇(ROS)產(chǎn)生及線粒體來源的ROS,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)變化各指標(biāo)、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ組分mRNA。結(jié)果 觀察組及對(duì)照組總ROS產(chǎn)生量分別為3 159±42.92、1 062±24.41，兩組比較，P<0.05。觀察組及對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)線粒體來源ROS產(chǎn)生量分別為1 254±29.04、1 039±17.32，兩組比較，P<0.05。觀察組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1分別是對(duì)照組的0.200 0、6.739 8、4.487 9、1.639 5倍，P均<0.05。觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組改變倍數(shù)分別為0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍，P均>0.05。觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平較對(duì)照組改變倍數(shù)分別為1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍，P均>0.05。結(jié)論 TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)總的ROS表達(dá)增加，但過量ROS并非來源于線粒體，機(jī)制可能是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)的關(guān)鍵酶從而改變細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

轉(zhuǎn)化生長因子-β；人卵巢癌細(xì)胞系；SK-OV-3細(xì)胞；活性氧簇；上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控者，其在卵巢癌復(fù)發(fā)灶的表達(dá)水平比卵巢癌原發(fā)灶高[1,2]，并且通過誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)從而增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力[3,4]。TGF-β信號(hào)通路改變引起的EMT等變化是腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要原因[5,6]。近期有關(guān)乳腺癌及腎癌的研究顯示，TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，并與癌細(xì)胞發(fā)生EMT密切相關(guān)[7,8]。但是，TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確。本研究觀察了TGF-β對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。MyCoy′5A培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清及TRIzol試劑購自Thermo Fisher公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Takara公司，CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1抗體購自Proteintech公司，TGF-β來源于R&D公司，CM-H2DCFDA、Mito-SOX染料購自Molecular Probes公司，2×實(shí)時(shí)熒光定量PCR mix購自Genecopoeia公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自BioRad公司，流式細(xì)胞分析儀購自Beckman公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 SK-OV-3細(xì)胞用含有10%胎牛血清的MyCoy′5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、含5%CO2濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)后以3×105/孔的細(xì)胞密度均勻接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分成兩組，觀察組用2 mL培養(yǎng)液+2 μL無血清DMEM配制的5 μg/mL TGF-β培養(yǎng)(最終濃度5 ng/mL)[9]，對(duì)照組直接加2 mL培養(yǎng)液，各組均為3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，做后續(xù)的RNA提取，每組重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3 細(xì)胞內(nèi)總ROS、線粒體來源ROS檢測(cè)方法 按照說明書，將CM-H2DCFDA及Mito-SOX染料加DMSO配制為10 mmol/L的儲(chǔ)液濃度，用37 ℃完全培養(yǎng)基稀釋1 000倍成為工作液；將培養(yǎng)的細(xì)胞棄掉原有的培養(yǎng)基，分別加入完全培養(yǎng)基稀釋完成的CM-H2DCFDA及Mito-SOX染料，避光，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20～30 min，棄去染料，用溫的PBS清洗1次，消化，用完全培養(yǎng)基終止，收集細(xì)胞，1 200 r/min離心，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光，CM-H2DCFDA用流式儀的FL1通道檢測(cè)，Mito-SOX用流式儀的FL2通道檢測(cè)，F(xiàn)lowjo 7.6軟件分析流式細(xì)胞儀所得的結(jié)果，結(jié)果以10 000個(gè)細(xì)胞熒光幾何平均值表示。

1.4 細(xì)胞EMT變化指標(biāo)、線粒體復(fù)合體Ⅲ主要成分mRNA檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將6孔板中不同觀察組的細(xì)胞用PBS洗1次，加入1 mL TRIzol試劑裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，測(cè)RNA濃度后，以oligodT逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄1 μg RNA為cDNA(反應(yīng)條件為42 ℃、1 h，72 ℃、10 min)。以cDNA為模板，按2×SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR mix的要求，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增及檢測(cè)(反應(yīng)條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s處檢測(cè)信號(hào)，循環(huán)40次；再65～95 ℃，每升高1 ℃收集1次熒光信號(hào)，做溶解曲線)。以GAPDH做為內(nèi)參，2-ΔΔCT表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平，ΔΔCT=(CT目的基因-CT管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT管家基因)對(duì)照組。引物由武漢天一輝遠(yuǎn)公司合成，序列見表1。

表1 各基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5 細(xì)胞內(nèi)線粒體復(fù)合體Ⅲ主要成分蛋白檢測(cè)方法 采用Western blotting法。收集不同處理?xiàng)l件的細(xì)胞，PBS清洗后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞蛋白，冰上裂解20 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，BAC法測(cè)蛋白，加5×loading buffer，90～100 ℃煮沸10 min后，SDS-PAGE檢測(cè)CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白。

2 結(jié)果

2.1 SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)總ROS產(chǎn)生量比較 觀察組及對(duì)照組總ROS產(chǎn)生量分別為3 159±42.92、1 062±24.41，兩組比較，P<0.05。

2.2 SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)線粒體來源ROS產(chǎn)生量比較 觀察組及對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)線粒體來源ROS產(chǎn)生量分別為1 254±29.04、1 039±17.32，兩組比較，P<0.05。

2.3 SK-OV-3細(xì)胞EMT變化指標(biāo)比較 經(jīng)過5 ng/mL TGF-β作用24 h后，SK-OV-3細(xì)胞發(fā)生明顯EMT變化，E-cadherin mRNA表達(dá)降低為對(duì)照組的0.20倍，N-cadherin、Vimentin、ZEB1分別是對(duì)照組的6.7398、4.4879、1.6395倍，P均<0.05。

2.4 SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)線粒體復(fù)合體Ⅲ主要成分mRNA比較 觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組改變倍數(shù)分別為0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍，P均>0.05。

2.5 SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)線粒體復(fù)合體Ⅲ主要成分蛋白比較 觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平較對(duì)照組改變倍數(shù)分別為1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍,P均>0.05。

3 討論

卵巢癌是影響女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率位于女性惡性腫瘤的第3位，但病死率卻排名第一。而卵巢癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)伴隨轉(zhuǎn)移，研究卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中的變化對(duì)卵巢癌的診治有重要意義。TGF-β是EMT的誘導(dǎo)者，也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子，多種腫瘤都可以觀察到TGF-β水平上調(diào)。由于TGF-β通過誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生EMT變化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，因此TGF-β水平上調(diào)被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的重要標(biāo)志[12,13]。研究TGF-β在卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中細(xì)胞發(fā)生的改變，將提供卵巢癌診治方面的新視角。

近期研究表明，TGF-β誘導(dǎo)的ROS信號(hào)通路改變與TGF-β引起的EMT相關(guān)[7,14]，但TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS升高的機(jī)制尚不清楚。因此，深入研究TGF-β如何誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS升高能更進(jìn)一步明確腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制。前期研究報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)ROS受多種因素調(diào)控，即NADPH氧化酶(Nox家族)、線粒體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、環(huán)氧合酶、細(xì)胞色素P450、黃嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶等，其中線粒體及Nox家族是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源[15]。前期研究顯示，過量ROS產(chǎn)生是TGF-β促進(jìn)腫瘤發(fā)生EMT的原因之一，所以抑制TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS將是腫瘤治療的一個(gè)方面。因此，探索TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞ROS產(chǎn)生機(jī)制是目前的研究熱點(diǎn)之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以誘導(dǎo)SK-OV-3發(fā)生EMT變化，進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總的ROS，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)總的ROS量明顯升高。雖然多數(shù)研究認(rèn)為線粒體尤其是線粒體復(fù)合體Ⅲ是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源，但我們研究發(fā)現(xiàn)TGF-β并未改變細(xì)胞內(nèi)線粒體來源的ROS產(chǎn)生量。進(jìn)而我們檢測(cè)SK-OV-3細(xì)胞在TGF-β作用后線粒體復(fù)合體Ⅲ主要組分mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示線粒體復(fù)合體Ⅲ主要組分CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA及CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白表達(dá)并無明顯變化。因此，本研究證明TGF-β升高細(xì)胞內(nèi)總的ROS并不來源于線粒體，TGF-β可能通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)的關(guān)鍵酶從而改變細(xì)胞內(nèi)的ROS，確切的生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(WX11B05)。

張慶華(E-mail： zhangqh66@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.008

R737.31

A

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2016-10-12)