姚文蓮，徐 薪

原子力顯微鏡對結合HER-2后乳腺癌細胞膜的觀察

姚文蓮，徐 薪

目的 通過原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)觀察人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)表達的乳腺癌細胞膜的表面形態(tài)變化，為提高乳腺癌HER-2檢測的敏感性和精確性提供新方法。方法 利用AFM分別觀察不同組織學類型的人類表皮生長因子受體抗體陽性表達和陰性表達的乳腺癌細胞膜表面形態(tài)特征并對特征參數(shù)平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷深度和表面積差值進行定量測量，采用統(tǒng)計學方法進行差異性分析。結果 HER-2陽性表達組的乳腺癌細胞形態(tài)和陰性表達組相比具有明顯的不同：HER2陰性表達的乳腺癌細胞膜隆起較“尖銳”，隆起物高且偏細，每個單倍計數(shù)面積內的隆起物數(shù)目較多；而HER2陽性表達的乳腺癌細胞膜隆起較“粗大”，隆起物低且偏粗，每個單位計數(shù)面積內的隆起物數(shù)目明顯減少。兩組細胞在平均粗糙度[(21.87±2.46)/(32.65±1.03),P<0.000]、平均峰高度[(13.94±1.01)/(31.15±3.89),P<0.001]、平均凹陷深度[(11.09±6.36)/(33.58±3.15),P<0.001]和表面積差值[(6.27±2.03)/(19.65±1.13),P<0.001]方面具有明顯差異(P<0.05)。不同組織學類型的乳腺癌細胞膜表面形態(tài)變化趨勢與此一致。結論 細胞膜表面結構因細胞功能狀態(tài)的不同而不相同。相同腫瘤細胞在不同功能狀態(tài)下，其細胞膜在形態(tài)結構上存在很大的差異，這為探討腫瘤的發(fā)生機制、發(fā)展過程和早期診斷及細胞診斷提供依據(jù)，為提高HER-2的陽性率診斷提供新方法。

原子力顯微鏡；乳腺癌；人類表皮生長因子受體2；細胞膜；形態(tài)特征

乳腺癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一。近幾年來，我國乳腺癌的發(fā)病率以每年3%的幅度逐年上升[1]，并且呈現(xiàn)年輕的趨勢。有數(shù)據(jù)顯示，目前北京、上海等地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率高達30/10萬，在女性惡性腫瘤中居第一位，成為威脅女性健康和生命的主要疾病[2]。大量研究表明，定位于染色體17q12-21.32上的HER-2基因，即HER-2基因的過度表達在乳腺癌細胞增殖方面起重要作用，與腫瘤患者的病情發(fā)展、腫瘤轉移及患者生存期的長短有關，并且還與患者對化療和內分泌治療的耐藥性有關，是獨立的不良預后因素。但是，HER-2的表達狀態(tài)的改變是如何體現(xiàn)在腫瘤的細胞膜上的？為什么不同HER-2表達狀態(tài)的腫瘤對治療的反應不同？在腫瘤的形態(tài)結構上有什么與之相對應的結構改變？目前尚未見此方面的報道。

AFM作為20世紀80年代發(fā)展起來的一項新技術[3，4]，與傳統(tǒng)的掃描電子顯微鏡相比，它具有很高的橫向和縱向分辨率。隨著納米醫(yī)學的發(fā)展，AFM于20世紀90年代后期開始成功地應用到生命科學領域的研究[5-7]，利用其精密的分辨率，可以清晰地觀察細胞乃至細胞膜的結構形態(tài)，成功地獲取細胞膜的形態(tài)并測量其相關特征參數(shù)。從而觀察腫瘤細胞的改變和不同，為其不同的生物學特性和治療提供形態(tài)學的證據(jù)。本研究利用AFM的這些優(yōu)勢來達到預期的目的。

1 材料與方法

1.1 標本 選取我院病理科2013-07至2014-07接收到的新鮮乳腺癌切除標本，共計53例。其中，男4例，女49例，18～76歲，平均(38.64±4.16)歲。乳腺浸潤性導管癌32例，黏液癌2例，小葉原位癌13例，其他類型6例。所有標本均經HE染色和免疫組織化學一步法染色后由3位以上高年資病理醫(yī)師作出明確診斷。

1.2 主要儀器及規(guī)格 (1)Nanoscope a型AFM(購自Digital InstrumentsInc，SantaBarbara，CA)(懸臂：氮化硅(Si3N4)懸臂；針尖：NSC-Ⅱ型，曲率半徑為20～30 nm；Tapping掃描模式，即輕敲模式)；(2)倒置相差顯微鏡(NIKONECLIPSETE2000-U，日本NIKON公司)

1.3 實驗條件 空氣濕度60%左右，溫度25 ℃左右。

1.4 方法

1.4.1 印片法制備AFM的細胞觀察樣品 將收集的新鮮乳腺癌組織用潔凈鋒利的刀片剖開，用吸水紙反復吸去剖面上的血跡、水分和組織液，然后將預先用1%的甲醛溶液處理好的載玻片輕輕的按壓于組織的剖面上，力求使細胞均勻的印在玻片上。每個組織剖面印5張切片，每個組織選擇3個切面。將印好細胞的載玻片置于1%的甲醛溶液中固定20 min，然后取出，置于潔凈的環(huán)境中晾干，分組，保存以備掃描。

1.4.2 分組 用免疫組織化學的EnVision法檢測HER-2的表達，并且根據(jù)其蛋白表達的強度進行評分(0、1+、2+、3+，其中2+和3+視為陽性，0和1+視為陰性)[8]。具體結果判讀如下：(1)0，完全沒有著色或者少于10%的腫瘤細胞有細胞膜著色；(2)1+，大于10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細胞膜著色；(3)2+，大于10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)弱至中度完整的細胞膜著色；(4)3+，大于10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)強的、完整的細胞膜著色[9]。

1.4.3 AFM掃描各組細胞樣品 將樣本置于AFM載物臺上，利用Nikon倒置顯微鏡選取合適的細胞區(qū)域(分散度較好、呈點狀分布的區(qū)域)，調整激光光斑于顯示器的中心位置，選擇自動調頻，自動下針以逐步靠近樣本直至接觸到樣本并開始掃描。動態(tài)觀察顯示屏出現(xiàn)的細胞圖像并隨時調節(jié)掃描位置，按照掃描由大到小的順序逐步掃描單個完整細胞和細胞膜并獲取圖像。每張樣品選取10個細胞，每個細胞掃描范圍介于35～500 nm之間。根據(jù)掃描需求在0.5～2.0 Hz調節(jié)掃描頻率。掃描完成的細胞和獲取的相應圖像進行特殊定位和標記，以備后續(xù)免疫組織化學染色進一步確認分組的準確性和目標細胞的正確性。掃描圖像保存后用AFM分析軟件進一步分析，分別觀察HER-2陽性組和陰性組細胞的細胞膜形態(tài)并對表面平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷深度和表面積差值等細胞膜形態(tài)參數(shù)進行定量測量。

1.4.4 免疫組織化學染色復核 將掃描完成的乳腺癌印片細胞進行HER-2受體的免疫組織化學染色，由3名主治以上的病理醫(yī)師讀片確認病例分組的準確性，并且根據(jù)定位，確認每個掃描細胞的HER-2受體著色分組無誤。

1.4.5 細胞膜表面參數(shù)定量分析 整理掃描范圍為1 μm區(qū)域的測量結果，利用AFM圖像分析系統(tǒng)對兩組細胞的細胞膜形態(tài)參數(shù)進行定量測量。

2 結 果

2.1 細胞印片法獲取的細胞樣本染色結果 采用新鮮組織印片法獲取的乳腺癌細胞樣本經1%的甲醛溶液固定后細胞形態(tài)結構完整，細胞膜、細胞核、核仁均清晰，利于AFM的觀察。印片法獲取的細胞分布均勻，重疊較少。在常規(guī)蘇木精-尹紅(HE)染色下，細胞質紅染，細胞核、核仁著藍色，核仁位于細胞的中央或者偏于一側(圖1)。免疫組織化學一部法染色結果，HER-2陽性表達的病例有21例，陰性表達的病例有32例；其中，浸潤性導管癌(14例陽性；18例陰性)，黏液癌(0例陽性；2例陰性)，小葉原位癌(5例陽性；8例陰性)，其他類型(2例陽性；4例陰性)。

圖1 印片法獲取乳腺癌細胞病理圖(HE，×100)

2.2 膜表面重要參數(shù)測量結果

2.2.1 乳腺癌膜表面重要參數(shù)測量結果 兩組(HER-2表達陰性組和陽性組)乳腺癌細胞膜在4個膜表面參數(shù)(最大峰高度、平均粗糙度、表面積差值和平均凹陷度)的比較上差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2.2 不同組織學類型的乳腺癌細胞膜表面重要參數(shù)測量結果 不同組織學類型的乳腺癌細胞膜的表面重要參數(shù)因HER-2的表達不同而差異具有統(tǒng)計學意義(表2)。

表1 不同HER-2表達的乳腺癌細胞膜表面平均峰高度、粗糙度、表面積差值和凹陷度 (n=7950；nm；

2.2.3 AFM掃描細胞成像三維圖形 不同組織學類型、不同HER-2表達的乳腺癌細胞在較大掃描范圍(40～30 μm)下呈現(xiàn)細胞的完整結構，細胞形狀為球形/橄欖球形，而隨著掃描范圍的不斷縮小，細胞膜的表面凹凸不平，出現(xiàn)不同程度的隆起，而隆起的形態(tài)因HER-2的表達不同而出現(xiàn)差異，這種差異在不同組織學類型的乳腺癌細胞的規(guī)律相似，即：HER-2陰性表達的乳腺癌細胞膜隆起較“尖銳”，隆起物高且偏細，每個單倍計數(shù)面積內的隆起物數(shù)目較多；而HER-2陽性表達的乳腺癌細胞膜隆起較“粗大”，隆起物低且偏粗，每個單位計數(shù)面積內的隆起物數(shù)目明顯減少。

表2 不同組織學類型及不同HER-2表達的乳腺癌細胞膜表面平均峰高度、粗糙度、表面積差值和凹陷度 (nm；

注：入組中黏液癌例數(shù)過少，尚不能進行比較分析

3 討 論

隨著近些年乳腺癌發(fā)病率和死亡率的明顯增高，探討乳腺癌的發(fā)病機制，尋找其早期精確診斷和預后判斷的敏感指標，從而探尋治療的新靶點、新突破，成為了當前乳腺癌研究的重點。1987年Slamon等[10]首先在乳腺癌細胞表面發(fā)現(xiàn)了HER-2。而后續(xù)的眾多研究都進一步明確了其在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預后和治療中的作用。

研究充分證實，HER-2能夠通過各種信號轉導途徑影響細胞骨架的重建、細胞運動、細胞間黏附以及蛋白酶表達和激活[11]。其過度表達能夠促進乳腺癌腫瘤的發(fā)生和惡性轉化。體外研究證實，轉染HER-2基因的乳腺癌腫瘤細胞株DNA合成能力增強，細胞生長速度加快，侵襲性增強，并且可以增強裸鼠的成瘤性和腫瘤的轉移能力。眾多的研究進一步表明，HER-2在判斷乳腺癌的預后包括病理學類型、TNM分期以及癌組織中ER、PR水平表達中可以作為獨立的指標[12，13]。同時，HER-2的表達水平還影響臨床中對乳腺癌患者手術方式的選擇；指導治療方案的制定和預測治療，甚至可以作為腫瘤對內分泌治療和化學藥物治療的預示指標。例如，HER-2過度表達提示預后不良，TNM分期為Ⅰ期的患者可以行乳腺全切，相反則可以選擇保乳治療[14]。

HER-2在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、治療和預后的過程中具有舉足輕重的地位。早期、精確、準確的測定其表達的特點，有助于臨床早期進行治療的選擇和不良預后的干預。HER-2作為細胞膜上的受體，直觀的觀察和測定會更有說服意義。而AFM的發(fā)現(xiàn)，為實現(xiàn)這一目標提供了可能。就針對乳腺癌的AFM研究，2009年Plodinec等[15]利用AFM觀察人乳腺癌細胞結合表皮生長因子抗體(HER-2)后細胞膜表面的變化，結合熒光成像發(fā)現(xiàn)癌細胞的細胞膜在粗糙程度等方面有明顯的變化并獲得了變化的立體結構圖像。2012年，Jin等[16]利用AFM發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白(BMP2)通過改變細胞的支架和降低細胞的黏附來促進如下年息報的遷移和侵襲。而在國內，陳勇和蔡繼業(yè)[17]也利用AFM觀察乳腺癌細胞外纖連蛋白原纖維空間分布和排列規(guī)律的形態(tài)學特征來探討乳腺癌的轉移機制。

在本研究中，借助AFM觀察細胞形態(tài)的優(yōu)勢，筆者發(fā)現(xiàn)，乳腺細胞在發(fā)生癌變后，細胞膜的形態(tài)特征會發(fā)生變化，在細胞膜形態(tài)參數(shù)的量值上具有明顯改變。乳腺癌細胞膜的表面均呈現(xiàn)為不同程度的隆起，而隆起的形狀則因HER-2的表達狀態(tài)不同而有明顯差異(P<0.05)：HER-2陰性表達的乳腺癌細胞膜隆起較“尖銳”，隆起物高且偏細，隆起之間的間隔“溝壑”較深，每個單倍計數(shù)面積內的隆起物數(shù)目較多；而HER-2陽性表達的乳腺癌細胞膜隆起較“粗大”，隆起物低且偏粗，隆起之間的間隔“溝壑”較淺，每個單位計數(shù)面積內的隆起物數(shù)目明顯減少。 而對于不同組織學類型(浸潤性導管癌、小葉原位癌、及其他類型的乳腺癌)的乳腺癌的細胞膜形態(tài)特征的變化趨勢與整體相一致(均P<0.05)。在本研究中，因收集病例中黏液癌的數(shù)量過少，數(shù)據(jù)統(tǒng)計不合理，結論尚不明確。

分析乳腺癌細胞膜形態(tài)的這種變化，是與其疾病的發(fā)生和進展相一致的。HER-2陰性表達的乳腺癌患者體內的基因尚未發(fā)生突變，其癌細胞膜表面的受體結合位點較多，在臨床中選擇基因靶向治療藥物的治療意義不大，相反，因為有功能受體位點的存在，選擇受體拮抗劑(內分泌治療)的治療意義較大。HER-2陽性表達的乳腺癌患者體內的基因發(fā)生了突變，其癌細胞的發(fā)生發(fā)展軌跡改變，體現(xiàn)在癌細胞膜表面的受體結合位點減少，功能降低甚至喪失。對于此類患者，因基因改變的緣故，對中晚期患者而言，手術治療和內分泌治療意義有限，而基因靶向治療的選擇就非常必要。

無論哪種類型癌癥的治療，時機的選擇非常重要，而最關鍵的則在于早期診斷和早期治療。盡管目前針對HER-2的檢測方式非常多，例如DNA水平上的PCR熒光原位雜交、顯色原位雜交和非熒光原位雜交等以及蛋白質水平上的免疫組織化學檢測法和酶標免疫法等，但是任何一種檢測方法均受到組織處理方法、固定時間、試劑等的影響，其結果判讀和解釋中存在較大的變異。因此實際操作中，HER-2的檢測結果敏感性和精確性都較低。相反，AFM值通過直接觀察乳腺癌細胞膜上的形態(tài)特征，組織來源于新鮮標本，對于組織的處理和試劑的需求較少，獲得的結果是直觀的可用數(shù)據(jù)說明的三維立體圖像。結果真實、可靠、敏感是其區(qū)別于其他檢查方式的特點。除此之外，AFM的測定對組織體積的需求較低，穿刺組織、針吸細胞均可實現(xiàn)測定。因此可以提高早期對HER-2狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)，結合后期其他技術方法的測定大大提高臨床的HER-2檢測準確性和敏感性，為臨床的治療工作提高可靠的依據(jù)指導。

綜上所述，AFM的發(fā)明和應用將在未來的醫(yī)學中具有很大的價值，尤其是現(xiàn)如今納米醫(yī)學、納米診斷和納米治療環(huán)境下對疾病早期診斷和微小診斷的需求中，AFM具有得天獨厚的優(yōu)勢。

[1]LapenseeEW,Ben-JonathanN.Novelrolesofprolactinandestrogensinbreastcancerresistancetochemotherapy[J].Endocrine-RelatedCancer, 2010, 17:R91-R107.

[2] 付 強,于世英,許三鵬.乳腺癌HER2過度表達預后相關因素研究[J].腫瘤防治研究,2008,35(3):14-16.

[3]BinnigG，RohrerH，GerberC，et al.SurfacestudiesbyScanningtunnelingMicroscope[J].PhysRevLett,1982,49:57-61.

[4]BinnigG，QuateCF，GerberC.Atomicforcemicroscope[J].PhysRevLett，1986,56(9):930-933.

[5]TiwariDK，TanakaS，InouyeY，et al.SynthesisandCharacterizationofAnti-HER2AntibodyConjugatedCdSe/CdZnSQuantumDotsforFluorescenceImagingofBreastCancerCell[J].Sensors(Basel),2009,9(11):9332-9364.

[6]ChengR,MengF,DengC,et al.Dualandmulti-stimuliresponsivepolymeric-nanoparticlesforprogrammedsitespecificdrugdelivery[J].Biomaterials,2013,34(14):3647-3657.

[7]Gez,Lius.Functionalblockcopolymerassembliesresponsivetotumorandintracellularmicroenvironmentsforsite-specificdrugdeliveryandenhancedimagingperformance[J].ChemicalSocietyReviews,2013,42( 17) :7289-7325.

[8] 《乳腺癌HER2檢測指南》編寫組.乳腺癌HER2檢測指南[J].中華病理學雜志,2006,35(10):631-633.

[9]SlamonDJ,ClackGM,WongSG,et al.Humanbreastcancer,correlationofrelapseandsurvivalwithamplificationoftheHER-2 /neuoncogene[J].Sciene,1987,235:177-181.

[10] 喬杉杉,王大業(yè).乳腺癌HER-2基因的研究進展及其靶點治療[J].首都醫(yī)科大學學報,2008,29(1):96-99.

[11] 劉 堯,劉文超,陶玉榮.HER-2過表達與乳腺癌治療的相關性研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2010,8(1):182-184.

[12]RossJS,FletcherJA.TheHER-2/neuoncogeneinbreastcancerprognosticfactor,predictivefactorandtargetfortherapy[J].StemCells,1998,16:413-428.

[13]BrowerFT,AhmedS,TartterP,et al.Prognosticvariablesininvasivebreastcancer,contributionofcomedoversusnon-comedoin-situcomponent[J].AnnSurgOncol,1995,2:440-444.

[14]CookeT,ReevesJ,LanniganA,et al.Thevalueofthehumanepidermalgrowthfactorreceptor2(HER-2)asaprognosticmarker[J].EurJCancer,2001,37(suppl1):S3-S10.

[15]PlodinecM,LoparicM,MonnierCA, et al.Thenanomechanicalsignatureofbreastcanaer[J].Nanotechnol, 2012, 7(11): 757-765.

[16]JinH,PiJ,HuangF, et al.BMP2promotesmigrationandinvasionofbreastcancercellsviacytoskeletalreorganizationandadhesiondecrease:anAFMinvestigation[J].Appl-MicrobiolBiotechnol,2012,2(93-94):1715-1723.

[17] 陳 勇, 蔡繼業(yè).AFM對人乳腺癌細胞外纖連蛋白原纖維的形態(tài)學觀察[J] .生物化學與生物物理學報, 2003, 35(8): 752-755.

(2016-12-11收稿 2017-04-21修回)

(責任編輯 岳建華)

Surface morphology of breast cancer cells combined with HER-2 by AFM

YAO Wenlian and XU Xin.
Department of Pathology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039 China

Objective To observe the morphological changes in the surface of breast cancer cell’s membrane with different expressions of human epidermal growth factor receptor-2 under the atomic force microscope(AFM)in order to provide a new method for improving the sensitivity and accuracy of HER-2 detection in breast cancer and stimulate new ideas for early diagnosis of tumor at the sub-cellular level.Methods Beast cancer cells of different histological types were divided into two groups based on their expression levels of human epidermal growth factor receptor-2: the positive group and negative group. The surface morphology of cells’ membrane was observed with atomic force microscopy respectively. Such characteristic morphological parameters as average roughness，mean peak-height，average maximum depth and surface area difference of these cells were quantitatively measured ,and the results were statistically analyzed.Results There was significant difference between the two groups in cellular morphology. The surface of positive cell membrane of human epidermal growth factor receptor-2(HER-2) was rough and uneven, and the tuberositas was high and thin, but the tuberositas was heavy and wide in the HER-2 negative group.There were more tuberosities in the positive group than in the negative group in each count area.The difference in morphological characteristics between the two groups was obvious in the average roughness[(21.87±2.46)/(32.65±1.03),P<0.000]，mean peak-height[(13.94±1.01)/(31.15±3.89),P<0.001]， average maximum depth[(11.09±6.36)/(33.58±3.15),P<0.001]and surface area[(6.27±2.03)/(19.65±1.13),P<0.001].Conclusions The surface structure of cell membrane varies with different functional states, which may give us an insight into the mechanism, development and early diagnosis of cancer. It could also provide a new method for the diagnosis of the positive rate of HER-2.

atomic force microscopy; breast cancer; HER-2; cell membrane; morphological characteristics

院級臨床類推廣應用項目(WZ2014042)

姚文蓮，碩士研究生，醫(yī)師。

100039 北京，武警總醫(yī)院病理科

徐 薪，E-mail:xxblaeflower@163.com

R730.5