劉婷雋

(徐州醫(yī)科大學實驗動物中心，江蘇 徐州 221000)

CBX2-1與p53相互作用的機制①

劉婷雋

(徐州醫(yī)科大學實驗動物中心，江蘇 徐州 221000)

目的：檢測CBX2-1與p53是否存在相互作用，并一步檢測CBX2-1與p53發(fā)生相互作用的結構域。方法：在大腸桿菌中表達GST-CBX2-1融合蛋白，GST pull down純化出蛋白與細胞裂解液混合，Western blot檢測兩個蛋白相互作用。同樣的方法進一步檢測CBX2-1與p53發(fā)生相互作用的結構域。結果：Western blot結果顯示CBX2-1與p53存在直接相互作用，相互作用的結構域是CBX2-1蛋白N端1-288肽段和259-600肽段及p53蛋白的98-292肽段。結論：CBX2-1蛋白通過N端1-288肽段和259-600肽段與p53蛋白98-292肽段相互作用，為進一步研究研究CBX2-1參與神經性列腺癌的機制提供了一定的理論基礎。

CBX2-1；p53；蛋白質相互作用

CBX2在發(fā)展性前列腺癌中最為潛在治療目標發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，在轉移型前列腺癌中CBX2的表達量持續(xù)增高，CBX2的高表達與較差的前列腺癌臨床效果具有相關性。另外，在轉移型前列腺癌的細胞株中，CBX2蛋白的缺失能夠抑制細胞的存活，并誘發(fā)caspase3介導的細胞凋亡[1]。人類CBX2存在兩個轉錄本，CBX2-1含有532個基因，CBX2-2含有211個基因[2]。前人的研究發(fā)現(xiàn),CBX2-1比CBX2-2表達量更高，對CBX2-1的探究更深入，于是本實驗選取CBX2-1作為研究對象。

新的研究表明[3]，在多種癌癥中，CBX2基因量和mRNA的上調標志著腫瘤遷移和低存活率的發(fā)生。臨床上，通過抑制CBX2的高表達作為藥物治療人類癌癥的重要手段。此外，CBX2還參與細胞周期的調控。有文獻報道，CBX2同源家族CBX8可以與p53協(xié)同作用調節(jié)結直腸癌中細胞的增殖[4]。而p53基因是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤發(fā)病相關性最大的抑癌基因之一，其功能主要包括細胞周期停止(分化或衰老)、DNA復制與修復及細胞凋亡[5]。既然CBX2和p53都是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要蛋白，兩者都可以調控細胞周期及細胞的分化，于是我們猜測CBX2-1是否與p53存在某種關系共同調節(jié)某些生命活動。而絕大多數(shù)蛋白都是通過與其他核酸或者蛋白發(fā)生相互作用來參與生物代謝過程的，那么CBX2-1與p53是否存在相互作用，成為本實驗的切入點。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，CBX2-1通過N端1-288肽段和259-600肽段兩個結構域與p53蛋白98-292肽段相互作用。

1 材料方法

1.1 材料

30%聚丙烯酰胺、凝膠上樣緩沖液、半干轉轉移緩沖液、Tris-Glycine電泳緩沖液、TBST、GST Resin 購于南京金斯瑞公司、兔抗鼠二抗(HRP標記)購于上海Genetech公司、flag抗體、CBX2抗體購于上海Abmart公司、ECL plus購于美國GE公司。

1.2 重組蛋白在原核細胞中的大量表達

將鑒定正確的重組質粒轉化大腸桿菌BL21,37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。過夜的培養(yǎng)液以1:50轉接于含100mL新鮮培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)1.5～2h，使OD值達0.4～0.6。加入IPTG(終濃度為0.5mM，37℃、250rpm條件下培養(yǎng)8h。

1.3 融合蛋白的純化

誘導后的細菌在4℃、5000rpm條件下離心15min，用冰PBS洗一次，離心去上清。取沉淀菌體，向沉淀中加入8mlPBS和終濃度為1mM的PMSF，超聲破碎大腸桿菌細胞，超聲條件為：超10s，停10s，40%功率，15min。整個超聲過程需在冰上進行，以防超聲過程中蛋白質預熱變性。

超聲后，12000rpm，離心15min取上清，分別與Glutathione Resin beads孵育，4℃旋轉過夜，次日，3000rpm，5min，離心收集珠子。用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗滌珠子，4℃旋轉5min，共5次。離心收集珠子，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色檢測純化結果。

1.4 GST pull down檢測蛋白質間相互作用

上述實驗中GST pull down后GST Sepharose beads 4℃留存；收集F293細胞，PBS緩沖液洗滌，加入細胞裂解液冰上裂解1h，4℃條件下12000r/min離心15min，取上清；將上清液與beads混合，4℃孵育過夜；用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗beads；SDS-PAGE電泳后WB檢測相互作用結果。

上述實驗中GST pull down后GST Sepharose beads 4℃留存，收集誘導表達His-Flag-CBX2的大腸桿菌，超聲劈碎菌液細胞，PBS重懸后beads混合，4℃孵育過夜；用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗beads；SDS-PAGE電泳后WB檢測相互作用結果。

1.5 Western Blot

細胞經一系列處理后經裂解液裂解，收取總蛋白(或收集beads，沸水煮沸5min，離心取上清)，等量的蛋白通過12%的SDS-PAGE膠進行跑膠分離，并轉移至PVDF膜上；洗滌后，用5%脫脂奶粉封閉，并分別用GST(1:2000)、p53(1:1000)、Flag(1:2000)、CBX2-1(1:500)抗體孵育，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入HRP標記的羊抗鼠(1:2000)二抗室溫孵育2h，TBST洗膜；ECL顯色、發(fā)光。

2 結果

2.1 CBX2-1與p53存在相互作用

由于CBX2與p53的功能存在一定的相似處，兩者都參與腫瘤的發(fā)展，并調控細胞分化與細胞周期。于是我們猜測CBX2-1與p53在空間上是否存在相互作用。我們純化GST-CBX2-1蛋白，與F293細胞裂解液進行GST pull down，然后用p53抗體檢測與CBX2-1相互作用。Western Blot結果表明，CBX2-1與p53存在相互作用(圖1)。

圖1 western blot檢測P53與CBX2-1相互作用

2.2 CBX2-1與P53存在直接相互作用

圖1的實驗結果表明了CBX2-1與p53存在相互作用，但并不能確定兩個蛋白之間是否可以存在直接相互作用，因此我們接下來通過原核表達的方法檢測兩個蛋白是否存在直接相互作用。我們首先通過PCR的方法將p53擴增出來，然后構建含有GST-標簽的PGEX質粒載體中，轉化至BL21中誘導表達。同時我們將CBX2-1構建到含有his-flag-標簽的pcold-2載體中在BL21中誘導表達。隨后通過GST-pull down親和純化GST-p53，純化后的p53與超聲的his-flag-CBX2-1菌液的超聲上清液孵育進行GST-pulldown實驗，用flag抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)CBX2-1與p53存在直接相互作用(圖2)。

圖2 Western blot檢測P53與CBX2-1存在直接相互作用

2.3 CBX2-1通過1-288和259-600兩段與p53蛋白相互作用

既然CBX2-1蛋白與P53之間可以存在直接相互作用，那么CBX2-1蛋白通過哪個結構域與其相互作用成為我們感興趣的問題。根據(jù)CBX2-1蛋白的結構與功能我們將其分成CBX2-1-1(1-288)、CBX2-1-2(259-600)、(601-1956)三段進行實驗,分別構建進帶有GST標簽的pGEX載體中，然后誘導表達，通過GST-pull down純化后，檢測是哪一段domain與p53發(fā)生作用。首先收集2盤10cm板的F293細胞，加入1.6ml的lysis buffer冰上裂解1h后離心取上清，將上清與純化出的GST-CBX2-1 3段蛋白混合過夜，用p53抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)CBX2-1主要通過1-288和259-600兩段與p53蛋白相互作用(圖3)。

圖3 Western blot檢測CBX2-1與p53蛋白相互作用的domain

2.4 p53通過98-252肽段與CBX2-1蛋白相互作用

同樣的，為了進一步研究p53蛋白與CBX2-1相互作用的結構域，我們根據(jù)p53蛋白的空間結構將其分為p53-1(1-97)，p53-2(98-292)，p53-3(293-393)三段進行實驗，構建成帶有GST標簽的融合蛋白，隨后GST pull down純化后與F293細胞裂解液混合，檢測是哪一段domain與CBX2發(fā)生作用。WB結果顯示p53蛋白主要通過98-292肽段與CBX2-1相互作用。

圖4 Western blot檢測p53與CBX2-1蛋白相互作用的domain

3 討論

多梳家族(PcG)蛋白可以作為組蛋白修飾激酶，通過調節(jié)染色質高級結構參與基因表達的調控。研究表明，PcG成員參與不同的細胞過程，例如干細胞分化、細胞命運決定、衰老、哺乳動物或腫瘤形成過程中調節(jié)X染色體的失活[6～8]。CBX2，是Pc家族同系物，N端含有染色質結構域，C端含有高度保守的Pc盒。在人類CBX2基因座上，含有兩個轉錄體，一個轉錄體是由5個外顯子組成含有532個基因的亞體CBX2-1，另一個轉錄體CBX2-2由4個外顯子組成包含211個基因。

p53是重要的腫瘤抑制因子，p53基因編碼的蛋白P53是一種轉錄因子，主要分布于細胞核漿，在正常情況下其功能就好似“基因衛(wèi)士”，監(jiān)測基因組的完整性，一旦發(fā)現(xiàn)損傷將激活一系列信號通路，包括細胞周期停滯、DNA修復、細胞凋亡，細胞衰老等[8，9]。

既然CBX2和p53都是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要蛋白，兩者都可以調控細胞周期及細胞的分化，于是我們猜測CBX2-1是否也可以與p53共同作用調節(jié)某種生命活動。

首先運用GST pull down原理發(fā)現(xiàn)CBX2-1與p53存在相互作用，為了檢測兩者之間是否可以存在直接相互作用，我們嘗試在大腸桿菌中分別誘導表達兩個蛋白進行pull down實驗。因此我們分別誘導表達了GST-P53和His-flag-CBX2進行pull down實驗，結果證實兩者之間可以存在直接相互作用。進一步分析兩者之間的相互作用機制，我們發(fā)現(xiàn)CBX2-1主要通過1-288肽段和259-600肽段與p53相互作用，并且p53通過98-292肽段與CBX2-1相互作用。

但這種相互作用對于CBX2-1功能具有何種意義，CBX2-1是否能和p53協(xié)同作用共同調節(jié)結腸癌中細胞的的增殖，其是否與神經性前前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關系，還需我們進一步證實。本文為研究CBX2-1參與神經性前列腺癌的機制提供了一定的理論基礎。

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江蘇省高校自然科學基金資助項目，編號：13KJD180003。

劉婷雋(1990～)女，江蘇徐州人，碩士，助理實驗師。

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1008-0104(2017)04-0084-02

2017-03-19)