黃信隆，張 威

(1.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

D980nm激光不同治療頻次對(duì)SD大鼠皮膚緊膚效果的對(duì)比性研究①

黃信隆1，張 威2

(1.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：研究經(jīng)過D980nm半導(dǎo)體激光不同治療頻次照射后，SD大鼠皮膚的膠原纖維、成纖維細(xì)胞、TGFβ1的變化，探討激光對(duì)大鼠皮膚緊膚效果的對(duì)比性變化，旨在作為D980nm半導(dǎo)體激光今后研究的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：選取18只SD大鼠建立動(dòng)物模型，分為I、II、III三組，每組6只，大鼠脊柱左側(cè)皮膚作為激光照射實(shí)驗(yàn)組，脊柱右側(cè)皮膚作為自身對(duì)照組。調(diào)節(jié)D980nm半導(dǎo)體激光儀設(shè)定參數(shù)，在皮下照射SD大鼠脊柱左側(cè)皮膚，I組照射1次，II組照射2次，間隔2min，III組照射3次，間隔2 min，各組間隔1周處理一次，共3個(gè)療程。第3個(gè)療程結(jié)束休息1周后，引頸處死大鼠，背部皮膚脫毛取材切片，通過應(yīng)用HE染色、免疫組化法，觀察激光照射前后大鼠皮膚膠原纖維和成纖維細(xì)胞變化，檢測(cè)分析TGFβ1表達(dá)在大鼠皮膚組織中的變化。結(jié)果：D980nm半導(dǎo)體激光進(jìn)行皮下照射后大鼠皮膚膠原纖維含量增加、成纖維細(xì)胞數(shù)量增加、TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)明顯，其中激光照射3次組，大鼠皮膚膠原纖維含量、成纖維細(xì)胞數(shù)量增加、TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)明顯，定量分析與各組比較，有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論：經(jīng)D980nm半導(dǎo)體激光皮下照射后SD大鼠皮膚的緊膚效果明顯，合適的治療頻次可以提高皮膚的緊膚效果，并且緊膚效果強(qiáng)弱和治療頻次有關(guān)。

激光；緊膚；膠原纖維；成纖維細(xì)胞；TGFβ1

皮膚重塑一直以來(lái)在人類史上都是人們夢(mèng)寐以求的目標(biāo)，其治療技術(shù)發(fā)展層出不窮，從面部年輕化皮膚手術(shù)治療[1]，脂肪移植改善皮膚質(zhì)地治療[2]，中藥改善瘢痕皮膚治療[3]，到現(xiàn)在激光重塑治療，其中激光在最近幾年發(fā)展迅速并用于治療皮膚光老化，尤其是D980nm波長(zhǎng)半導(dǎo)體激光作為激光治療新模式在脂肪溶脂、改善瘢痕和治療光老化方面已證實(shí)有一定的效果，并在臨床治療中有初步的應(yīng)用，但目前臨床上對(duì)于D980nm激光對(duì)皮膚起到緊膚效果的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。而且，到現(xiàn)在為止激光的眾多研究多限制于臨床有效性的總結(jié)，而對(duì)其治療機(jī)制的基礎(chǔ)性研究甚少。并且臨床上，患者進(jìn)行激光治療后，觀察其皮膚組織結(jié)構(gòu)的變化并不是特別方便，其具體機(jī)制還有待深入研究[4～6]。在人類皮膚中起關(guān)鍵構(gòu)造并且分布最為廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)成分是膠原纖維，關(guān)鍵是它確定了皮膚的強(qiáng)度和形態(tài)[7]。膠原由成纖維細(xì)胞合成，后者是作為皮膚真皮網(wǎng)織層中最主要的細(xì)胞[8]。較常見的有關(guān)創(chuàng)傷修復(fù)的細(xì)胞因子，主要是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (TGFβ1)，并且它是促使成纖維細(xì)胞增殖分裂的重要細(xì)胞因子，其中TGFβ1是促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的主要因子[9]。目前，成纖維細(xì)胞、膠原纖維、TGFβ1細(xì)胞因子在D980nm波長(zhǎng)半導(dǎo)體激光緊膚中的定量分析和評(píng)估至今鮮有報(bào)道。我們以SD大鼠建立動(dòng)物模型，經(jīng)D980nm激光不同治療頻次后，觀察大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)變化，并檢測(cè)分析成纖維細(xì)胞、TGFβ1因子在大鼠皮膚組織中的變化情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器、試劑

隨機(jī)選取清潔級(jí)18只SD大鼠，雄性，體重400～450g，12～14個(gè)月齡，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心供應(yīng)飼養(yǎng)。德國(guó)塞拉姆D980激光治療儀(Ceramoptecgmbh公司，德國(guó))。兔抗人TGFβ1多克隆抗體，SABC檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模方法

將SD大鼠18只，隨機(jī)標(biāo)號(hào)分為3組，每組6只，標(biāo)為I、II、III3組。激光前動(dòng)物預(yù)備麻醉，對(duì)大鼠進(jìn)行稱重計(jì)算所用麻醉劑量 (300mg/kg)，然后用10%的水合氯醛溶液以腹腔注射的方式進(jìn)行充分的麻醉，待麻醉顯效后，實(shí)驗(yàn)中以大鼠脊柱為分界線分為左右兩個(gè)對(duì)稱區(qū)域，每個(gè)區(qū)域?yàn)?cm×3cm，左側(cè)為實(shí)驗(yàn)區(qū)域，常規(guī)脫毛、腫脹麻醉后，供使用D980nm激光對(duì)皮下組織進(jìn)行處理，右側(cè)對(duì)稱部位為對(duì)照區(qū)域，只做常規(guī)脫毛、腫脹麻醉，不做其他處理。每側(cè)脫毛暴露區(qū)域?yàn)?cm×4cm。腫脹麻醉液：2%利多卡因1000mg+腎上腺素1mg+每升生理鹽水含10mL碳酸氫鈉。預(yù)標(biāo)記區(qū)域皮下充分浸潤(rùn)麻醉。將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。根據(jù)臨床、相關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)選出合適的激光嫩膚參數(shù)組合，脈沖模式下，采用D980nm波長(zhǎng)行激光溶脂嫩膚，各實(shí)驗(yàn)組能量密度均保持20J/cm2，功率為8W，脈沖寬度為20ms，脈沖頻率40Hz。I組用功率為8W的激光處理1遍，II組用功率為8W激光處理2遍，時(shí)間間隔為2min，III組用功率為8W的激光處理3遍，時(shí)間間隔為2min。各組每間隔1周處理一次，各組共3個(gè)療程，當(dāng)?shù)?個(gè)療程后停歇恢復(fù)1周。在實(shí)驗(yàn)組區(qū)域左下角作一直徑為1mm的圓形微小切口，把激光儀的光纖探頭套在金屬導(dǎo)管內(nèi)，把金屬導(dǎo)管穿過微小切口進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組區(qū)域皮下脂肪組織進(jìn)行均勻皮下照射，作用于皮膚真皮層和皮下脂肪層,用設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法作用于實(shí)驗(yàn)組，手術(shù)中用手持式紅外測(cè)溫槍監(jiān)督并檢測(cè)大鼠皮膚體表溫度變化，照射體溫要求小于42℃，手術(shù)后用冷凝膠均勻涂抹背部大鼠皮膚，并密切觀察大鼠的狀態(tài)。對(duì)照組不做處理。

1.2.2 標(biāo)本取材、處理和染色

在大鼠第3個(gè)療程結(jié)束休息1周后，引頸處死大鼠，脫凈背部實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各標(biāo)記區(qū)域的體毛，用組織剪快速剪下各組標(biāo)記區(qū)域的皮膚組織塊，大小為1cm×1cm×0.5cm，標(biāo)記清楚，在10%的中性福爾馬林中固定。 固定48h后，常規(guī)石蠟包埋后按每張5μm厚度作連續(xù)切片。每批次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞判斷及計(jì)數(shù)：隨機(jī)選擇每組6張免疫組化染色切片，在每張組織切片中隨機(jī)選擇5個(gè)400倍的高倍細(xì)胞視野，以真皮成纖維細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的包漿出現(xiàn)黃或黃褐色著色作為陽(yáng)性表達(dá)，記錄每個(gè)視野中陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

各自身對(duì)照組：大鼠皮膚中膠原纖維數(shù)量較少，分散排列于真皮層中，且纖維之間空隙較大，成纖維細(xì)胞數(shù)目稀少(圖1X)。各實(shí)驗(yàn)組間對(duì)比：I組為1次照射組顯示膠原纖維數(shù)量變多，纖維空隙減少，但雜亂排列，成纖維細(xì)胞增加不明顯(圖1I)；II組為2次照射組顯示膠原纖維數(shù)量上變多，纖維空隙略有減少，纖維增粗，似平行排布，成纖維細(xì)胞數(shù)量少量增加(圖1II)；III組為3次照射組顯示膠原纖維數(shù)量顯著變多，纖維間空隙減少，排列整齊有序緊密，成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯增加(圖1III)。從D980nm激光照射治療后，實(shí)驗(yàn)組與自身對(duì)照組相比較，膠原纖維含量增多明顯，形態(tài)上變粗，纖維間空隙減少，纖維排列緊密，走向與表皮平行分布，并且更加整齊有規(guī)則，成纖維細(xì)胞數(shù)量增多。見圖1。

圖1 D980nm激光不同治療頻次照射后皮膚膠原纖維和成纖維細(xì)胞變化 X.對(duì)照組(×100) I.1次照射組(×100) II.2次照射組(×100) III.3次照射組(×100)

2.2 TGFβ1表達(dá)結(jié)果

I、II、III三組治療頻次的激光進(jìn)行皮下照射處理后，SD大鼠皮膚組織中的TGFβ1因子表達(dá)增強(qiáng)，其實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于自身對(duì)照組，并且有顯著性差異(P<0.01)。兩兩比較，I組實(shí)驗(yàn)組和II實(shí)驗(yàn)組比較，TGFβ1表達(dá)呈現(xiàn)明顯的差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，III實(shí)驗(yàn)組數(shù)值結(jié)果顯示TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)最明顯，與I、II實(shí)驗(yàn)組比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1，圖2。

表1 D980nm激光不同治療頻次照射后大鼠 皮膚中TGFβ1表達(dá)結(jié)果

圖2 D980nm激光不同治療頻次照射后TGFβ1表達(dá)變化 X：對(duì)照組(×400) I：1次照射組(×400) II：2次照射組(×400) III：3次照射組(×400)

3 討論

半導(dǎo)體激光是高強(qiáng)度光源激光，皮膚組織中多種吸色團(tuán)即靶目標(biāo)可同時(shí)吸收一定的光能，產(chǎn)生多種光熱解效應(yīng)，光熱解效應(yīng)的一個(gè)原則是靶組織吸收足夠的熱量產(chǎn)生組織的熱損傷。組織損傷后即啟動(dòng)創(chuàng)傷愈合過程[10]。在研究激光進(jìn)行皮下照射時(shí)，當(dāng)足夠的能量熱損傷達(dá)到一定程度后仍能發(fā)生局部炎癥反應(yīng)，激光的熱損傷愈合過程與別的因素引起的創(chuàng)傷愈合過程有一定的共同性和特殊性，在該愈合修復(fù)進(jìn)程中，皮膚膠原纖維、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞因子變化規(guī)律是如何的。

在激光溶脂中，激光可直接破壞液化脂肪細(xì)胞，并且激光的熱效應(yīng)能夠減少出血，促進(jìn)皮膚收緊。最早JA Muccini，F(xiàn)E O'Donnell等研究在光老化致皮膚松弛膠原變性后可采用980 nm半導(dǎo)體激光治療光老化所導(dǎo)致的纖維組織病變[11]。有研究得出激光形成的生物光熱作用,造成膠原纖維面積增加[12]。有人在采用D980nm激光照射的動(dòng)物研究中，結(jié)果表明I型膠原纖維含量實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組[13]。成纖維細(xì)胞(fibroblast)是疏松結(jié)締組織中數(shù)目最多、最多見的細(xì)胞成分，可劃分為成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞，它對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損修復(fù)有著非常重要的作用。組織熱損傷可刺激功能停止的纖維細(xì)胞活化為活躍的成纖維細(xì)胞，發(fā)動(dòng)組織修復(fù)機(jī)制。我們的研究顯示，SD大鼠皮膚受D980nm波長(zhǎng)激光皮下照射后，實(shí)驗(yàn)組與自身對(duì)照組相比，可明顯觀察到成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，膠原纖維含量增加明顯，形態(tài)上增粗，纖維排列緊密，走向與表皮平行分布，并且更加整齊有規(guī)則。由上述激光照射后皮膚結(jié)構(gòu)變化中發(fā)現(xiàn)，提示激光可能刺激停止的纖維細(xì)胞活化為活躍的成纖維細(xì)胞，促使大量成纖維細(xì)胞增殖，并且合成了許多膠原蛋白，且其效果與治療頻次有關(guān)。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明TGFβ1可促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化增殖，并能刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白等基質(zhì)，抑制蛋白酶和基質(zhì)酶活性，從而使細(xì)胞外基質(zhì)沉積[9]。激光的高熱效應(yīng)可促進(jìn)真皮膠原新生，當(dāng)激光照射時(shí)，皮膚組織中的水、脂肪、血紅蛋白等靶物質(zhì)吸收光轉(zhuǎn)化成熱能，皮膚溫度增高，產(chǎn)生損傷發(fā)動(dòng)創(chuàng)傷修復(fù)響應(yīng)，釋放TGFβ1等細(xì)胞因子(cytokine，CK)，并刺激成纖維細(xì)胞活化增殖合成了新膠原。在炎癥反應(yīng)中，對(duì)修復(fù)免疫系統(tǒng)的整體調(diào)節(jié)上，TGFβ1還發(fā)揮了很重要的作用[14]。較常見與創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)的CK為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ1)，并且它是促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分裂的重要CK。我們的研究表明在細(xì)胞因子方面，大鼠皮膚組織中TGFβ1在經(jīng)過D980nm激光進(jìn)行皮下照射治療后表達(dá)增強(qiáng)，并且治療前后有顯著性差異(P<0.01)。其中III組實(shí)驗(yàn)組明顯高于其余實(shí)驗(yàn)組，并且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，提示TGFβ1表達(dá)強(qiáng)弱與激光治療頻次有關(guān)。由此表明，SD大鼠皮膚受D980nm波長(zhǎng)激光皮下照射后能使皮膚膠原纖維含量、成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)，并且增加及表達(dá)量與激光照射頻次密切有關(guān)，其中3次照射組，大鼠皮膚膠原纖維含量、成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)顯著，定量分析與各組比較，有顯著性差異(P<0.01)。這個(gè)結(jié)果也表明激光治療頻次是影響D980nm波長(zhǎng)激光嫩膚效果的一個(gè)重要因素，不同的激光治療頻次可以產(chǎn)生不同的機(jī)制反應(yīng)，因此使用合適的激光治療頻次來(lái)提高激光作用效果是非常有必要的，并且為后續(xù)的研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和線索。

但是由于激光緊膚產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，有多種細(xì)胞、多種信號(hào)通路參與，有諸多因素介入影響，不能研究透徹反應(yīng)機(jī)制，只能部分闡明幾個(gè)重要影響因素。并且因?yàn)檠芯拷?jīng)費(fèi)以及時(shí)間上的限制，對(duì)于治療頻次的最優(yōu)頻次，如何達(dá)到激光各種治療參數(shù)的最優(yōu)化，包括波長(zhǎng)、能量、脈寬、脈寬頻率、治療間隔時(shí)間等，以及如何更好契合激光與其它溶脂緊膚治療技術(shù)的應(yīng)用，這些問題，有待下一步的研究。

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佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YM2016 - 080。

黃信隆(1988 ～)男，浙江溫州人，在讀碩士研究生。

張威(1963 ～)男，黑龍江哈爾濱人，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E - mail:kinwai01@163.com。

R454.2

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1008-0104(2017)04-0074-03

2016-12-04)