劉 敏，朱艷麗，張雪梅，逄德志，楊 哲，艾迎春

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清治療急性胰腺炎的實驗研究①

劉 敏，朱艷麗，張雪梅，逄德志，楊 哲，艾迎春

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)培養(yǎng)上清對大鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis ,AP)模型的作用。方法:采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化MSCs，培養(yǎng)至第3代，取MSCs培養(yǎng)上清超濾離心備用。將SD大鼠隨機(jī)分為對照組(n=20)、模型組(n=28)和干預(yù)組(n=28)，每組再完全隨機(jī)分為1d、2d、3d、7d四個亞組。模型組和干預(yù)組注射L-精氨酸溶液制備急性胰腺炎模型，對照組注射等體積生理鹽水。造模1h后，干預(yù)組經(jīng)尾靜脈輸注MSCs培養(yǎng)上清，模型組和對照組注射等體積低糖DMEM。末次注射后1d、2d、3d、7d后分別處死各亞組大鼠，觀察胰腺組織病理學(xué)變化，測定血漿淀粉酶、胰腺組織中白介素-6 ( IL-6) 、腫瘤壞死因子-α( TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平。結(jié)果:與對照組比較，模型組血淀粉酶顯著升高，胰腺組織病理損傷嚴(yán)重。與模型組對比，干預(yù)組胰腺組織病理損傷程度減輕，IL-6及TNF- a水平減低，除1d亞組外，余三個亞組中TGF-β1水平顯著升高。結(jié)論:MSCs培養(yǎng)上清可有效治療L-精氨酸誘導(dǎo)的大鼠急性胰腺炎，其作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)胰腺組織IL-6、TNF- a、和TGF-β1水平相關(guān)。

急性胰腺炎；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；L-精氨酸；TGF-β1

急性胰腺炎是一種臨床常見的疾病，由各種原因引起的胰腺組織自身消化、水腫、甚至出血壞死的全身炎癥反應(yīng)性疾病，嚴(yán)重時可引起多器官功能障礙，危及生命[1]。隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，雖在內(nèi)科治療為主的多學(xué)科參與的綜合治療下，治療效果有所改善，仍有部分患者治療效果不佳。近年來，隨干細(xì)胞研究的深入，在胰腺炎治療方面，干細(xì)胞移植成為一個新的研究方向。因MSCs易于獲取，廣泛應(yīng)用于臨床和實驗研究[2]，在治療急性胰腺炎中亦取得了較理想的效果，但MSCs移植可能存在培養(yǎng)后致瘤性、靜脈輸注肺部儲留等多種風(fēng)險[3]，受到許多爭議。有研究證實，在許多疾病治療方面，MSCs培養(yǎng)上清與MSCs有相似作用[4]，因此本實驗利用L-精氨酸誘導(dǎo)急性胰腺炎大鼠模型，觀察MSCs培養(yǎng)上清對急性胰腺炎的治療作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物：健康、雄性清潔級SD大鼠82只，包括8周齡76只，體重200～220g，4周齡6只，體重80～100g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供。

主要儀器和試劑：低糖DMEM(Hyclone公司)， CO2恒溫培養(yǎng)箱(GOLD-SIM公司)，低溫離心機(jī)(Beckman Coulter公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司),多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)，胎牛血清(Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，L-精氨酸 (上海翊圣公司)，IL-6、TNF-a、TGF-β1ELISA試劑盒(博士德公司)，熒光抗體(BD公司)等。

1.2 方法

1.2.1 MSCs分離、培養(yǎng)和鑒定：4周齡幼鼠斷頸處死，在超凈工作臺內(nèi)，完整分離股骨，PBS液沖洗并去除表面附著肌肉等組織，剪斷股骨兩端并用低糖DMEM5mL反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1000r/min離心4min，棄上清，低糖DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS，100U/L青霉素，100U/L鏈霉素)重懸，接種培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3代時，通過流式細(xì)胞儀，鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45。

1.2.2 MSCs 培養(yǎng)上清液收集：第3代MSCs細(xì)胞鋪滿瓶底約80%時棄掉原培養(yǎng)基，換用低糖DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后收集培養(yǎng)液于離心管中，1200×g，4℃下離心10min，取上清。將上清液過0.22μm濾膜至3KDa超濾管中，4℃，5000×g，超濾離心30min，-80℃保存。

1.2.3 分組及模型誘導(dǎo)：實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實驗前禁食水12h，實驗開始后恢復(fù)正常。將8周齡大鼠完全隨機(jī)分為3組，其中對照組20只，模型組和干預(yù)組28只。再將各組完全隨機(jī)分為1d、 2d、3d、7d四個亞組。模型組：應(yīng)用15%L-精氨酸溶液，按200mg/100g，間隔1h，腹腔注射3次，末次注射1h后經(jīng)尾靜脈注射低糖DMEM 250μL/100g。干預(yù)組：同上建立急性胰腺炎模型， 但按250μL/100g輸注MSCs培養(yǎng)基上清。對照組：腹腔內(nèi)注射等體積生理鹽水，間隔1h，共3次，末次注射1h后，經(jīng)尾靜脈注射低糖DMEM培養(yǎng)基。每日觀察大鼠基本情況。

1.3 標(biāo)本留取、儲備

在末次注射后1d、 2d、3d、7d，分別處死相應(yīng)亞組大鼠。腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛0.5mL/100g，麻醉后開胸，心尖取血3mL，置于促凝管中，3800r/min，4℃，離心5min，留取血清備用。腹正中切口，取胰腺組織切分，分別置于10%中性甲醛及-80℃冰箱中備用。

1.4 指標(biāo)觀察與測定

1.4.1 胰腺組織病理學(xué)評分：胰腺組織經(jīng)10%中性甲醛固定后，梯度酒精脫水、石蠟包埋，選擇5μm切片行HE染色。兩位病理科醫(yī)師盲法閱片，光鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，根據(jù)Schmidt評分標(biāo)準(zhǔn)評估胰腺組織的損傷程度，各項的積分總和為最終得分，5個視野的平均分為每張切片的最后病理評分[5，6]。

1.4.2 血清淀粉酶和胰腺組織IL-6、TNF- a、和TGF-β1測定：應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶含量。取胰腺組織，稱重后加入生理鹽水，低溫勻漿機(jī)制成10%的勻漿，4℃，3800r/min離心10min后取上清, 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA 法)檢測IL-6、TNF- a、和TGF-β1水平，測定方法按照試劑盒說明嚴(yán)格操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MSCs間充質(zhì)細(xì)胞鑒定

第3代細(xì)胞，流式細(xì)胞學(xué)測定CD29+CD44+CD45-比例95.14%。

2.2 大鼠基本情況

對照組大鼠的反應(yīng)比較靈敏，呼吸相對比較平穩(wěn)，狀態(tài)良好，實驗中無死亡；模型組與干預(yù)組大鼠模型實驗過程中分別死亡4只和3只，存活大鼠狀態(tài)萎靡，反應(yīng)遲鈍，皮毛色澤，進(jìn)水量增加。

2.3 大鼠胰腺組織大體及組織病理學(xué)表現(xiàn)

對照組胰腺大體呈現(xiàn)粉紅色，無滲出、出血等。光鏡下，胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整，間質(zhì)無滲出。模型組胰腺色暗紅，體積增大，輪廓欠清晰，表面明顯充血、水腫，可見出血，部分少量黃白色鈣皂斑。光鏡下間質(zhì)水腫、充血，小葉及腺泡間隙增寬，可伴有大量炎細(xì)胞的浸潤，散在分布有細(xì)胞壞死及出血，7d亞組胰腺組織明顯萎縮，顯微鏡下見腺泡增生與萎縮并存。干預(yù)組較模型組病理損傷明顯減輕(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠各組胰腺組織病理學(xué)評分±s ，分)

2.3 血清淀粉酶測定

與對照組比較，模型組中1d、2d、3d亞組中血淀粉酶顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 血清淀粉酶水平比較

2.4 IL-6、TNF- a和TGF-β1測定

與模型組對比，干預(yù)組IL-6及TNF- a水平顯著減低(P<0.05)，而TGF-β1水平除1d亞組外，余三個亞組中顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組胰腺組織IL-6、TNF-a和TGF-β1水平比較

3 討論

AP是臨床常見疾病，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確, 隨著研究深入, 細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)失衡理論的重要性已得到公認(rèn)。MSCs通過分泌各種生長因子及細(xì)胞因子，抑制炎癥、促進(jìn)組織修復(fù)等改善胰腺損傷，MSCs用于急性胰腺炎的治療成為研究熱點。但細(xì)胞移植一直存在歸巢率低、損傷環(huán)境中移植存活率低、培養(yǎng)后致瘤性、靜脈輸注肺部儲留等問題。目前有實驗研究表明，MSCs培養(yǎng)上清，在減輕急性肺損傷，促進(jìn)生殖細(xì)胞損傷修復(fù)方面與細(xì)胞移植有相同效果[4、7]。本實驗應(yīng)用MSCs培養(yǎng)上清作用于急性胰腺炎大鼠模型，觀察MSCs培養(yǎng)基對于急性胰腺炎作用。IL-6、TNF-a是重要炎癥因子，在急性胰腺炎時增多，可通過直接或間接的途徑催化、放大炎性反應(yīng)，致使組織細(xì)胞受損，而且因子水平及持續(xù)時間可用于評估急性胰腺炎嚴(yán)重程度[8]。TGF-β1有調(diào)控細(xì)胞增殖和分化, 刺激多種細(xì)胞外基質(zhì)成分合成的作用，在急性胰腺炎時，參與胰腺細(xì)胞修復(fù)、再塑的過程[9]。本實驗結(jié)果顯示，干預(yù)組胰腺組織病理損傷程度減輕，IL-6及TNF-a水平減低，除1d亞組其他三個亞組中TGF-β1水平顯著升高。表明了MSCs培養(yǎng)上清對大鼠急性胰腺炎胰腺損傷具有一定治療作用，其作用機(jī)制可能與降低炎癥因子IL-6、TNF- a水平抑制炎癥，以及提高TGF-β1的水平，促進(jìn)胰腺修復(fù)相關(guān)。在實驗中仍然存在許多問題，例如在MSCs上清注射時，注射方式、劑量及次數(shù)有多種選擇中，本實驗僅采用尾靜脈單次大劑量，其他方法是否效果更佳，需要進(jìn)一步探索，再如治療的副反應(yīng)等其他方面亦需要長時間的觀察，仍然有待研究。

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佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號: YM2016_034。

劉敏(1988～) 女，山東濰坊人，在讀碩士研究生。

艾迎春(1960～) 女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:772701045@qq.com。

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1008-0104(2017)04-0053-02

2017-02-16)