王 超，于 蓮，季方茹，雷力力

(1.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院藥劑科,黑龍江 佳木斯 154003)

MTHFR基因多態(tài)性在黑龍江東部地區(qū)腦卒中患者的頻率分析①

王 超1，于 蓮1，季方茹2，雷力力2

(1.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院藥劑科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的：分析黑龍江省東部地區(qū)健康人群和腦卒中患者中5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR) C677T、A1298C基因多態(tài)性的分布情況。方法：在黑龍江東部地區(qū)選取225例腦卒中患者和169例健康人群為測試對象，檢測其MTHFR C677T、A1298C位點的基因多態(tài)性，統(tǒng)計并分析黑龍江東部地區(qū)基因多態(tài)性的分布特征。結果：MTHFR C677T基因型中健康組與腦卒中組人群的基因攜帶頻率之間無顯著性差異(χ2=2.269，P>0.05)。MTHFR A1298C基因型中2組人群基因頻率沒有顯著性差異(χ2=0.159，P>0.05)。C677T和A1298C兩個基因位點之間連鎖后的9種基因型在2組人群中無顯著性差異(χ2=8.202，P>0.05)。結論：我省東部地區(qū)MTHFR C677T、A1298C的3中基因類型在健康組與腦卒中組人群中沒有差異性，C677T和A1298C基因型組合在2組人群中無差異性，腦卒中患者的發(fā)病因素可能不僅與基因型有關，其他不確定因素進一步導致了其發(fā)病率。

亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；腦卒中

腦卒中(cerebral stroke)是以腦血管病變而引起的高致殘率、高致死率的疾病，尤其患有高血壓、糖尿病等高危因素的人群中其發(fā)病率明顯上升。目前，我國腦卒中患者人數(shù)呈上升趨勢，而且趨于年輕化[1]。亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetrahydrofolate reductase MTHFR)是葉酸在體內(nèi)代謝的關鍵酶，該酶的活性能直接影響人體內(nèi)血漿同型半胱氨酸的含量。通常MTHFR的兩個常見的突變基因位點是C677T和A1298C，這兩個基因位點的錯義突變導致677位堿基C被T置換，1298位A置換為C從而改變了MTHFR的氨基酸結構，影響了MTHFR酶的活性，最為顯著的表現(xiàn)為MTHFR酶活性下降，這就使得同型半胱氨酸無法正常完成向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化，從而造成血同型半胱氨酸的含量明顯升高[2]，進而導致腦卒中的易感性。

當前國內(nèi)外對于MTHFR C677T和A1298C的研究有很多，種群、地域等因素導致研究結果不盡相同。然而，就目前對我國腦卒中高發(fā)地區(qū)之一的黑龍江東部地區(qū)，研究數(shù)據(jù)較少。同時對于以C677T和A1298C兩個基因位點作為相互關聯(lián)因素研究的數(shù)據(jù)為零。因此，本實驗組擬定科學合理的實驗方法，在黑龍江東部地區(qū)適宜人群中選取適宜樣本，探討MTHFR C677T和A1298C位點的基因多態(tài)性在健康人與腦卒中患者中的分布情況，為我省在精準醫(yī)療的發(fā)展上提供實驗室數(shù)據(jù)支持，指導臨床合理用藥，以減少腦梗死疾病和痛苦，達到合理預防、提高生存質(zhì)量的目的。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取黑龍江東部地區(qū)自2015-10～2016-02來我院進行腦卒中檢查的人群，以及本實驗組隨機選取的健康人，其中健康人共計169例，腦卒中患者共計225例，均為漢族，平均年齡為(61.7±8.5)歲。腦卒中患者篩選的指標均按照“全國第四屆腦血管會議制定的腦梗死診斷標準”執(zhí)行[3]，同時腦卒中患者都經(jīng)過本院MRI或(和)CT檢查并確診。

1.2 研究方法

基因型的檢測：本實驗采用熒光染色原位雜交法對樣本基因進行采集：①富集白細胞:取待測樣本200μL新鮮全血加入到1100μL氯化銨溶液中，混勻后室溫放置5min，然后離心機離心5min(3000r/min 700g) ，用移液槍吸取上清液，保留管底白細胞。②裂解保存:在富集白細胞的試管中加入50μL耀金保，用槍吹吸并震蕩試管混勻。③加樣:取1.5μL直接加入到待測基因?qū)囊鸱衷噭┲?，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Spss 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理，計數(shù)采用χ2檢驗，以P<0.05具有顯著性差異。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡

依據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡，檢驗采集到的MTHFR C677T、A1298C位點數(shù)據(jù)，健康組與腦卒中組理論頻數(shù)之間差異性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明本實驗采集的樣本具有群體代表性。

2.2 MTHFR基因多態(tài)

2.2.1 本省東部地區(qū)健康人群與腦卒中人群中MTHFR C677T的基因頻率分布比較是(表1)：C677T位點可分為CC基因型、CT基因型、TT基因型三種基因型，健康組中3種基因型頻率分別為20.7%、47.3%、32.0%，C和T等位基因頻率為44.4%、55.6%；腦卒中組的3種基因型頻率為13.3%、52.0%、34.7%，C和T等位基因頻率為39.3%、60.7%。兩組基因類型的總體分布頻率無顯著性意義(χ2=2.269，P>0.05)。兩組中C與T的等位基因頻率分布無顯著性意義(χ2=0.517，P>0.05)。

表1 MTHFR C677T的基因頻率分布[n(%)]

2.2.2 健康人群與腦卒中患者中MTHFR A1298C的基因頻率分布比較是(表2)：A1298C位點可分為AA基因型、AC基因型、CC基因型三種基因型，健康組中3種基因型頻率分別為58.6%、38.5%、2.9%，A和C等位基因頻率為77.8%、22.2%；腦卒中組的3種基因型頻率為57.8%、37.8%、4.4%，A和C等位基因頻率為76.7%、23.3%。兩組基因類型的總體分布頻率無顯著性意義(χ2=0.159，P>0.05)。兩組中A與C的等位基因頻率分布無顯著性意義(χ2=0.029，P>0.05)。

表2 MTHFR A1298C的基因頻率分布[n(%)]

2.2.3MTHFRC677T和A1298C兩個基因位點連鎖后的基因頻率分布比較(表3)。健康組中C677T與A1298C連鎖后的9中基因型頻率分別為CCAA9.5%、CCAC9.5%、CCCC1.8%、CTAA23.7%、CTAC23.1%、CTCC0.6%、TTAA25.4%、TTAC5.9%、TTCC0.6%，腦卒中組中兩種基因型連鎖后的頻率分別為CCAA4.4%、CCAC7.6%、CCCC1.3%、CTAA29.3%、CTAC19.6%、CTCC3.1%、TTAA24%、TTAC10.2%、TTCC0.4%。兩組基因類型的總體分布頻率無顯著性意義(χ2=8.202，P>0.05)。

表3 MTHFR C677T和A1298C連鎖后的基因頻率分布[n(%)]

3 討論

MTHFR基因位于人體染色體1p36.3，常見的研究類型有677C>T、1298A>C兩個位點[4]。目前，國內(nèi)外有大量的研究顯示，這2個基因位點堿基對的改變將直接導致MTHFR活性的降低，導致其反應過程中甲基代謝能力的降低，進而導致如同型半胱氨酸的升高[6]，同型半胱氨酸(Hcy)與腦血管疾病的發(fā)生有著密切的關系。同時，其與心臟病、糖尿病等腦卒中發(fā)生的高危因素也有關聯(lián)[5]。本實驗研究顯示，我省東部地區(qū)健康人群中與腦卒中患者MTHFR C677T和A1298C兩個基因位點的頻率之間沒有統(tǒng)計學意義。健康組與腦卒中組兩個基因位點中分別形成的3種基因類型具有相關性，沒有差異性。C677T和A1298C兩個位點連鎖后的9種基因型在健康組與腦卒中組中也沒有差異性。說明我省東部地區(qū)MTHFR基因型分布沒有差異性，健康人群與腦卒中患者在發(fā)病率上與其攜帶的基因型沒有關聯(lián)。國內(nèi)已有大量文獻報道，MTHFR C677T和A1298C基因中突變型在健康人群和腦卒中患者中具有顯著差異，突變型基因會導致腦卒中危險因素發(fā)生的概率[7]。然而，我省東部地區(qū)基因型之間沒有區(qū)別，說明健康人群與腦卒中患者在發(fā)病原因可能因為其他因素導致。本省是我國腦卒中的高發(fā)地區(qū)之一，每年腦卒中患者呈增長趨勢，隨著分子生物學和精準醫(yī)學的快速發(fā)展，疾病與一些藥物相關的基因多態(tài)性之間的相關性研究越來越受關注[8～10]，如何有效、合理的知道患者用藥已經(jīng)成為醫(yī)療工作者面對的問題。從基因?qū)用鎮(zhèn)€體化用藥，不僅能得到好的治療效果，更能減輕藥物的毒副作用，增加患者的耐受性。本實驗的研究結果說明我省東部人群體內(nèi)攜帶的MTHFR C677T和A1298C兩個位點的3中基因型較我國其他地方水平高，這可能會增加我省東部地區(qū)患腦卒中等相關疾病的風險。

[1]侯東哲, 高曉剛, 孫巖偉，等. 青年腦卒中分布狀況及危險因素分析[J].中國實驗診斷學, 2010, 14(7):1156-1158

[2]Perales D,Martinez de J,Villarreal LE,et al.Folic acid levels homocysteine and polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase enzyme (MTHFR)in patients with pre-eclampsia and eclampsia [J]. Gineco Lobstet Mex,2001,23(69):6-11

[3]中華神經(jīng)科學會全國第四屆腦血管病學術會議.各類腦血管疾病診斷要點[J].中華神經(jīng)科雜志,1996,29(6):379

[4]Wang X，F(xiàn)u J，Li Q，et al． Geographical and ethnic distributions of the MTHFR C677T，A1298C and MTRR A66G gene polymorphisms in Chinese populations: a meta-analysis[J].PLoS One,2016,11(4):0152414

[5]Pezzini A, Del Zotto E, Padovani A. Homocysteine and cerebral ischemia: pathogenic and therapeutical implications[J]. Curr Med Chem,2007, 14(3):249-263

[6]Fan SJ，Yang BY，Zhi XY，et al． Are MTHFR C677T and MTRR A66G polymorphisms associated with overweight/obesity risk from a case-control to a meta-analysis of 30，327 subjects[J].Int J Mol Sci,2015,16(6):11849-11863

[7]周憲梁,胡愛華,惠汝太，等.MTHFR基因多態(tài)性及血漿同型半胱氨酸水平與腦卒中的關系[J].中華心血管病雜志,1999，27(2)：121-123

[8]王歆,方舟,方芳，等.糖尿病患者IRS-1和MTHFR基因多態(tài)性分析[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2015,38(6):46-47

[9]左璐,方芳,楊軍 等.佳木斯地區(qū)健康人群與高血壓患者CYP3A4*1G基因多態(tài)性分析[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2015,38(1):7-9

[10]孫玲玲,方芳,荊洪英,等. MTHFR C677T 基因多態(tài)性與復發(fā)性自然流產(chǎn)相關性的 Meta分析[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2015,38(6):52-55

佳木斯大學研究生創(chuàng)新項目，編號：YM2016_097。

王超(1986～)男，山東青島人，在讀碩士研究生。

雷力力(1958～)女，黑龍江佳木斯人，學士，主任藥師，碩士研究生導師。E-mail：leill888@126.com。

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1008-0104(2017)04-0048-03

2016-12-17)