王心彧， 關(guān) 鍵，孫國姝，李德超

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯市口腔病防治院，黑龍江 佳木斯 154002)

Gefitinib與5-FU、CDDP及X線聯(lián)合應(yīng)用對OSCC離體細胞抑制效果的研究①

王心彧1， 關(guān) 鍵1，孫國姝2，李德超1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯市口腔病防治院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：研究吉非替尼(gefitinib)與5-氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑(CDDP)聯(lián)合作用于口腔鱗狀細胞癌(OSCC)體外培養(yǎng)細胞株與單一作用對鱗癌細胞抑制強度有無差別，及差別程度；研究吉非替尼與放射線共同作用對口腔鱗癌離體細胞滅活作用與單一放射線作用的差別。方法：①將3例口腔鱗狀細胞癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織進行離體細胞培養(yǎng)，傳代穩(wěn)定后加入96孔板分組加藥，分為A、B、C、D、E五組，每組3復(fù)孔，各組分別加5-FU、CDDP、gefitinib、getitinib+5-Fu、gefitinib+CDDP。37℃、5%CO2孵育24h，MTT法檢測各組吸光值，計算各組抑制情況進行組間比較。②將三種細胞每種分為對照組、X線組、吉非替尼組和吉非替尼+X線組，計數(shù)后分別加入6cm培養(yǎng)皿1×106個/皿(每組設(shè)置3皿重復(fù))，孵育24h，吉非替尼組及吉非替尼+X線組加入含2.5μL的DMEM 5mL其余組更換DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)24h，在達到12h后X線組接吉非替尼組+X線組給予8Gy X線照射后繼續(xù)孵育12h后進行MTT檢測。結(jié)果：①D、E兩組細胞抑制效果明顯好于A、B、C三組。分別統(tǒng)計各組組間差異性，經(jīng)檢驗：OSCC1: AD組:P<0.01、BE組:P<0.01、CD組:P<0.01、CE組:P<0.05；OSCC2: AD組:P<0.01、BE組:P<0.05、CD組:P<0.05、CE組:P<0.01；OSCC3: AD組:P<0.05、BE組:P<0.05、CD組:P<0.05、CE組:P<0.01。各配對組間統(tǒng)計均有統(tǒng)計學(xué)意義。②Gefitinib與X線聯(lián)合應(yīng)用后對各組鱗癌細胞滅活作用顯著增強，對照吉非替尼組，去除藥物本身對鱗癌細胞抑制作用影響后，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算吉非替尼對X線放射有增敏作用。結(jié)論：Gefitinib作為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，單獨作用于口腔鱗癌細胞有抑制細胞生長的作用，但與細胞毒類化療藥物5-FU，重金屬類化合物化療藥物CDDP以及常規(guī)X線放射治療方法聯(lián)合時則能較大提高放化療藥物敏感性。為臨床聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。

吉非替尼；5-氟尿嘧啶；順鉑；放射線；聯(lián)合作用；口腔鱗狀細胞癌

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)目前采用手術(shù)結(jié)合術(shù)后化療治療為主，化療藥物常見的有5-FU、CDDP及平陽霉素等，放射治療以X線照射為主。目前對于表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸酶抑制劑Gefitinib的研究主要集中在肺部非小細胞肺癌臨床化療治療中。有實驗證明，在口腔鱗狀細胞癌體外培養(yǎng)細胞EGFR有不同程度表達[1,2]，單純應(yīng)用吉非替尼對口腔鱗癌細胞有抑制作用。本實驗通過對臨床手術(shù)OSCC患者手術(shù)切除腫瘤瘤體癌細胞體外培養(yǎng)細胞株分別加入Gefitinib、5-FU、CDDP以及Gefitinib與其他兩種藥物配伍應(yīng)用；吉非替尼與X線聯(lián)合應(yīng)用，觀察各種方式對細胞株的抑制作用。為臨床化療的聯(lián)合用藥及放化療結(jié)合提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

OSCC患者手術(shù)切除新鮮腫瘤組織、低糖DMEM(達爾伯克必需基本培養(yǎng)基)、吉非替尼(商品名：易瑞沙 Iressa)、5-氟尿嘧啶、順鉑、MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍)、超凈工作臺、CO2恒溫箱、分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 人口腔鱗癌細胞培養(yǎng)

選取三名術(shù)前病理診斷為鱗癌患者新鮮切除腫瘤瘤體中外部部分腫瘤組織，置入內(nèi)含0.9%氯化鈉注射液的無菌病理袋內(nèi)，帶至實驗室，在超凈工作臺內(nèi)將腫瘤組織用滅菌雙蒸水沖洗3次后剪碎置入微試管，PBS反復(fù)吹打洗凈切面血液后小心棄液，加入0.1%Ⅱ型膠原酶液500μL，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化1h，反復(fù)吹打后取上層消化液1000rpm離心10min，棄上清液PBS混勻后離心，反復(fù)4次后棄上清液，DMEM 1mL混勻后接種于6cm直徑含5ml DMEM的培養(yǎng)皿中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[3]。

1.2.2 成纖維細胞的排除

本實驗去除成纖維細胞采用反復(fù)貼壁法[4]：待細胞生長到一定數(shù)目時棄去培養(yǎng)液，0.01%胰蛋白酶(trypsin)消化后PBS沖洗2次，離心后棄上清，加DMEM 1mL混勻。取標號為1、2、3的培養(yǎng)皿，將該液置入1號內(nèi)，入恒溫箱孵育10min后拿出，輕搖后全部吸出培養(yǎng)液，置入2號，恒溫箱孵育10min，同時向1號皿加5mL DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)。如上方法將2號皿內(nèi)液體置入3號，同時繼續(xù)培養(yǎng)。24h后觀察，3號皿內(nèi)為較純凈癌細胞[5]。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及分組

37℃、5%CO2將純凈癌細胞傳至第5代時，進行分組：A組：5-FU組、B組： CDDP組、C組： Gefitinib組、D組：Gefitinib+5-FU組、E組：Gefitinib+CDDP組。后進行細胞計數(shù)并接種至96孔板，密度1×105/孔，每組設(shè)置3復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組，培養(yǎng)24h。

1.2.4 細胞加藥

分別與DMEM配置5-FU 1mM/L、CDDP 500μM/L；取成品易瑞沙(Iressa)無菌研磨后配制成100μM/mL。按照5-FU 6nM/孔、CDDP 3nM/孔、Gefitinib 300nM/孔[6]，加入前三組，按與前三孔相同數(shù)量配伍后對應(yīng)加入后兩孔，每孔內(nèi)加DMEM 至200μL，置入恒溫箱孵育24h。

1.2.5 MTT法檢測

棄去各孔內(nèi)液，每孔加入150μL DMEM，后加0.5%MTT 50μL 繼續(xù)孵育4h后，棄去液體，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150μL ,置搖床上低速震蕩10min，在分光光度計570nm處測量各孔的吸光值(A)。

1.2.6 放射線實驗

將細胞計數(shù)后接種于6cm培養(yǎng)皿中，每細胞接種四組(A對照組、B單純放射組、C吉非替尼組，D吉非替尼+放射組)，每組三皿， 5×106個/皿，培養(yǎng)24h后C、D組中加入含Gefitinib 0.3μM/mL的DMEM 5mL，A、B兩組更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，孵育24h。 B、D兩組在孵育12h時一同進行8Gy 6mV X線照射后繼續(xù)孵育12h，棄去原培養(yǎng)液后將各組細胞消化后移至試管，離心后5mL DMEM 充分混勻按100μL/孔加入96孔板后每孔填加DMEM100μL后繼續(xù)培養(yǎng)24h后MTT法檢測各孔吸光值[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件對各組抑制效果組間用t檢驗。整個實驗重復(fù)3次，取每次每組3復(fù)孔以對照組吸光值為單位進行標準化，取得平均值，進行標準差分析。

2 結(jié)果

2.1 化療

經(jīng)化療后，經(jīng)測定其吸光度來檢測各類化療方法對鱗癌細胞的影響效果，見表1。經(jīng)統(tǒng)計比較后發(fā)現(xiàn)，5-FU聯(lián)合Gefitinib及CDDP聯(lián)合Gefitinib對鱗癌細胞的抑制作用顯著優(yōu)于單用藥物(P<0.05)。

表1 化療后各組細胞吸光度平均值a

a：各組值均為重復(fù)測量三次后取平均值

b：A組與D組兩組間比較(P<0.05)，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異。c：B組與E組兩組間比較(P<0.05)，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異。d：C組與D組兩組間比較(P<0.05)，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異。e：C組與E組兩組間比較(P<0.05)，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 放療

經(jīng)放療后，經(jīng)測定其吸光度來檢測各類放療方法對鱗癌細胞的影響效果，見表2。經(jīng)統(tǒng)計比較后發(fā)現(xiàn)，X射線放射聯(lián)合Gefitinib治療對鱗癌細胞的抑制作用顯著優(yōu)于單用X線放射治療(P<0.05)。

表2 放療后各組細胞吸光度平均值a

a：各組值均為重復(fù)測量三次后取平均值；b：X+G組與單純X線組比較(P<0.05)，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

有實驗證明Gefitinib對鱗癌細胞有抑制生長的作用，吉非替尼是一種選擇性表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，該酶通常表達于上皮來源的實體瘤。對于EGFR酪氨酸激酶活性的抑制可妨礙腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移和血管生成，并增加腫瘤細胞的凋亡。在體內(nèi)，吉非替尼廣泛抑制異種移植于裸鼠的人腫瘤細胞衍生系的腫瘤生長，并提高化療、放療及激素治療的抗腫瘤活性[8]。在臨床實驗中已證實吉非替尼對局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌具客觀的抗腫瘤反應(yīng)并可改善疾病相關(guān)的癥狀。而5-FU及CDDP是在臨床上比較常用的治療口腔鱗狀細胞癌化療用藥[9，10]，X線照射也是常規(guī)放療方法。本實驗結(jié)果表明兩種藥物通過與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用，作用于鱗癌細胞后效果均好于單獨應(yīng)用，統(tǒng)計學(xué)顯示各關(guān)系組組間對照結(jié)果顯示起到超相加效應(yīng)(P<0.05)。聯(lián)合治療療效評價采用細胞存活分數(shù)(SF)和AUC率的比較分析，比較分析采用t檢驗。藥物劑量對超相加作用的影響采用單因素方差分析(ANOVA)。Gefitinib聯(lián)合放療療效及Gefitinib聯(lián)合化療(5-FU、CDDP)放療的療效評價采用“相加效應(yīng)，(P>0.05)即藥物+放療(或放化療)的附加效應(yīng);“超相加效應(yīng)”(P<0.05)即大于藥物+放療(或放化療)的附加效應(yīng)亦即協(xié)同效應(yīng)。通過該結(jié)果我們分析5-FU為細胞毒類化療藥物，CDDP屬于重金屬類化療藥物，而Gefitinib選擇性的抑制EGFR，其作用于細胞位置不同能夠起到相加作用(P<0.05)，而Gefitinib選擇性抑制EGFR后能否增加5-FU、CDDP及X線作用強度還需進一步實驗證實。因此，聯(lián)合應(yīng)用對口腔鱗癌細胞抑制效果是肯定的。另外各樣本細胞對照的不均等性與該鱗癌細胞EGFR表達從本次實驗結(jié)果看成正相關(guān)性，具體表達量與抑制強度增幅作用之間的關(guān)系也還需要進一步實驗證明。

綜上所述，由于EGFR靶向抑制劑Gefitinib和傳統(tǒng)抗癌放化療治療是通過不同細胞毒機制來發(fā)揮作用，因此在兩者聯(lián)合治療提高療效的同時，并沒有治療所帶來的毒性疊加作用，這一理論為聯(lián)合治療提供了很好的治療前景。

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Highlights:Objective: To investigate the difference and the degree of the difference between the single effect of deitinib (gefitinib), 5- fluorouracil (5-FU), cisplatin (CDDP) and the combination of three drugs to oral squamous cell carcinoma (OSCC) cell lines in vitro; to compare the difference between the somatic inactivation effect of gefitinib combined with radiation and the single effect of gefitinib to OSCC. Methods:①OSCC cells were available from the fresh tumor tissue of 3 carcinoma patients. Cells were cultured and stable passage. Cells were added into 96 hole plate and divided into 5 groups. 5-FU, CDDP, gefitinib, gefitinib plus 5-gu, and gefitinib plus CDDP was applied to the cells of each group respectively. MTT assay was used to measure and compare the inhibitory effect of the drugs. ②Cells were divided into control group, x-ray group, gefitinib group, x-ray plus gefitinib group. Cells were counted and added into 6cm dish and incubated for 24h. 5ml DMEM was added to gefitinib group and gefitinib+x-ray group. The other two groups remained cultured 24h after replacement of DMEM. 8Gy x-ray was applied to cells of x-ray group and gefitinib+x-ray group. MTT assay was used to detect the survival rate of the cells after 12h incubation. Result:①Group D and E cells had better inhibitory effect than the other groups. The statistics significant difference between each 2 groups were as follows: OSCC1: group A and D:P<0.01; group B and E:P<0.01; group C and D :P<0.01; group C and E:P<0.05; OSCC2: group A and D:P<0.01; group B and E:P<0.05; group C and D:P<0.05; group C and E:P<0.01；OSCC3: group A and D:P<0.05; group B and E:P<0.05; group C and D:P<0.05; group C and E:P<0.01.Each matched groups has statistical significance. ②Gefitinib and x-ray joint application enhanced deactivation of OSCC cells. Gefitinib had the ability to increase the sensitization of x-ray by statistics calculation after removal the inhibitive influence of gefitinib. Conclusion: As a epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, Gefitinib can inhibit the growth of OSCC cells. Moreover, Gefitinib combined with 5-FU CDDP and conventional X-ray radiation therapy can improve the sensitivity of chemotherapy and radiotherapy.

Study on the inhibitive effect of Gefitinib combined with 5-FU,CDDP and X-ray to OSCC cells

WANGXin-yu1,GUANGJian1,SUNGuo-shu2,LIDe-chao1

(1.The Department of Oral Surgery of Stomatology Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154002,China；2.Oral Department of Jiamusi Centro-Hospital,Jiamusi 154004,China)

Gefitinib; 5-FU; CDDP; joint action; OSCC

佳木斯大學(xué)自然科學(xué)面上項目，編號：S2011-044。

王心彧 (1980～)男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士，主治醫(yī)師。

R445.4

B

1008-0104(2017)04-0043-03

2017-03-14)