張倩倩 郭尚敬,2*

(1山東省聊城大學(xué)藥學(xué)院 252000； 2 山東省聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院 252000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，淋巴瘤發(fā)病率逐年增加，其中非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin′s lymphoma, NHL)是臨床最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤。NHL占中國(guó)整個(gè)腫瘤發(fā)生的4%，死亡率居第14位[1～4]。對(duì)于這類惡性腫瘤，傳統(tǒng)的治療方式主要是放化療、骨髓移植或外周血造血干細(xì)胞移植等。然而，對(duì)于許多難治性、復(fù)發(fā)性及對(duì)化療和干細(xì)胞移植耐受力較差的患者而言，研發(fā)低毒性、更有效的靶向性治療方法顯得尤為重要。本文簡(jiǎn)介抗CD20的單克隆抗體藥物，并綜述人源化CD20單克隆抗體親和力和免疫原性的研究進(jìn)展。

1 抗CD20的單克隆抗體藥物

近年來(lái)，單克隆抗體及靶向治療NHL的臨床試驗(yàn)研究取得了重大進(jìn)展，其中被廣泛使用且富有成效的是抗CD20的單克隆抗體藥物[5]。CD20分子是一種B淋巴細(xì)胞表面的特異性膜蛋白，以非糖基化形式存在。CD20分子有4個(gè)跨膜區(qū)，氨基端和羧基端都位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)側(cè)，在第三跨膜區(qū)和第四跨膜區(qū)之間，有一個(gè)由43個(gè)氨基酸組成的環(huán)區(qū)(large loop)，構(gòu)成其主要的抗原表位[6，7]。該抗原表位僅存在于前B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞和超過(guò)95%的惡性B細(xì)胞表面，而不表達(dá)于造血干細(xì)胞、漿細(xì)胞和其他組織中，且其與抗體結(jié)合后無(wú)顯著內(nèi)化和脫落，也不因與抗體結(jié)合而發(fā)生抗原調(diào)變，從而成為治療B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的理想靶點(diǎn)[8]。

目前有多個(gè)以CD20為靶點(diǎn)治療非霍奇金淋巴瘤的單抗藥物已被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)上市(表1)。這些CD20單抗與B細(xì)胞淋巴瘤表面抗原結(jié)合后，主要通過(guò)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)以及抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞降解[9]。該藥可特異性地與B淋巴細(xì)胞表面的CD20 抗原結(jié)合，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，為B細(xì)胞NHL的治療提供了新的希望。

表1 FDA批準(zhǔn)的治療非霍奇金淋巴瘤的單抗藥物

2 單克隆抗體藥物的免疫原性

自1997年上市以來(lái)，利妥昔單抗(Rituximab)的銷售成果—直較好，2007年旳銷售額達(dá)到了22億美元，2012年增長(zhǎng)到67億美元，毫無(wú)疑問地成為單克隆抗體藥物市場(chǎng)的主導(dǎo)藥物。但是，由于Rituximab是一種人鼠嵌合型的抗CD20抗體，抗體分子中仍然包含約30% 的鼠源序列，這類鼠源單克隆抗體進(jìn)入人體后可能引起人抗鼠抗體免疫應(yīng)答(HAMA)，導(dǎo)致無(wú)法長(zhǎng)期用藥，嚴(yán)重制約Rituximab的使用。為此，需要降低該類藥物的免疫原性，并提高其抗腫瘤活性，達(dá)到增加藥效的目的。

從結(jié)構(gòu)上看，Rituximab作為人鼠嵌合抗體，雖然含有人的Fc段，但抗體的重輕鏈可變區(qū)仍然是鼠源序列，分子中30%的氨基酸序列來(lái)源于鼠抗，仍被人體視為外源蛋白，具有免疫原性，誘發(fā)人體產(chǎn)生中和抗體，降低持續(xù)性用藥的治療效果。為進(jìn)一步降低CD20抗體中鼠源序列的免疫原性，出現(xiàn)了以PDL公司的“complementarity-determining region，CDR”移植為主要手段的抗體人源化技術(shù)[10]。該技術(shù)將鼠抗的CDR區(qū)移接連入人抗體的框架區(qū)，從而減少鼠抗框架區(qū)導(dǎo)致的免疫原性。

盡管如此，這類抗體的人源化框架與鼠源性CDR區(qū)的氨基酸組合也可能被T細(xì)胞識(shí)別而引起免疫應(yīng)答。T細(xì)胞對(duì)異源蛋白的識(shí)別主要由抗原呈遞細(xì)胞表面的MHC II與蛋白多肽結(jié)合后，呈遞給T細(xì)胞受體，進(jìn)而活化淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，在設(shè)計(jì)選擇人源框架時(shí)，應(yīng)盡可能降低其框架多肽與MHC II分子的結(jié)合，從而使人源化抗體的免疫應(yīng)答降低到最小。張海峰(專利US 20130089540A1)采用獨(dú)特的抗體人源化技術(shù)，在鼠單抗2B8(Rituximab的原始鼠源單抗)的序列基礎(chǔ)之上，設(shè)計(jì)選擇了與MHC II結(jié)合位點(diǎn)少的人胚系(germline)抗體框架序列進(jìn)行鼠源單抗2B8的人源化，大大減少了免疫原性，從而得到人源化的CD20抗體。通過(guò)該技術(shù)改造的人源化CD20抗體分子，表現(xiàn)出了較低的免疫原性。但因其未對(duì)該抗體的親和力進(jìn)行任何修改，其殺傷腫瘤細(xì)胞的活性仍較低，仍需增加藥效提高其抗腫瘤活性，因此親和力的提高是非常必要的。

3 單克隆抗體藥物的親和力

抗體親和力是指抗原決定簇和抗體分子可變區(qū)互補(bǔ)構(gòu)型的結(jié)合強(qiáng)度。親和力越大表示抗體的結(jié)合反應(yīng)越快，抗原抗體復(fù)合物越不易解離。親和力的高低是由抗原分子的大小以及抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原決定簇之間立體構(gòu)型的合適度決定的。對(duì)于高度表達(dá)CD20的B細(xì)胞惡性淋巴瘤，Rituximab的臨床療效已得到肯定，但其臨床反應(yīng)率僅50%左右，完全緩解率只有10%[11]。隨著治療應(yīng)用的推廣，仍不斷發(fā)現(xiàn)難以治愈的惡性淋巴瘤病例，且該類腫瘤一旦復(fù)發(fā)，其耐藥再治療的緩解率極低，為此需要不斷提高單克隆抗體的親和力，從而提高其抗腫瘤的活性。

迄今為止，提高抗體親和力的方法主要是以原親本單抗為改造模板，通過(guò)構(gòu)建其突變體抗體庫(kù)(如核糖體展示、酵母雜交、噬菌體展示文庫(kù)等)進(jìn)行篩選，最終獲得更高親和力的單克隆抗體。但以上這些技術(shù)都具有各自的局限性：如難以構(gòu)建能覆蓋所有位點(diǎn)、可以突變成任何氨基酸的抗體文庫(kù)；構(gòu)建抗體庫(kù)及篩選過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)財(cái)?shù)取＝陙?lái)，應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬突變方法提高抗體親和力的技術(shù)，已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。趙磊等在前期得到的Rituximab/CD20抗原肽共結(jié)晶的基礎(chǔ)上，通過(guò)基于抗體進(jìn)化規(guī)律的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，將重鏈可變區(qū)57位天冬氨酸和102位酪氨酸分別突變成谷氨酸和賴氨酸，將輕鏈可變區(qū)93位天冬酰胺突變成精氨酸，使Rituximab的親和力提高了15.47倍。盡管該三點(diǎn)組合突變體極大地提高了抗體的親和力，但由于其整個(gè)可變區(qū)都是異源的，在進(jìn)行臨床試用時(shí)仍能夠被人體的免疫系統(tǒng)識(shí)別而產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，因此有必要對(duì)鼠單抗可變區(qū)作進(jìn)一步的人源化改造。

4 展望

進(jìn)行抗體的人源化有兩個(gè)基本原則，即保持或提高抗體的親和力和特異性，以及大大降低或基本消除抗體的免疫原性。但是目前為止，CD20抗體的人源化與親和力的提高都是分別進(jìn)行的，還沒有發(fā)現(xiàn)將這兩者同時(shí)進(jìn)行的設(shè)計(jì)與改造，從而獲得既有低免疫原性又有高親和力的抗體藥物。開發(fā)既有低免疫原性又有高親和力的抗體藥物，不僅具有重要的理論價(jià)值，而且具有巨大的應(yīng)用前景。