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        小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜的影響

        2017-08-30 13:38:22劉逸超付楊郭瀅郭琦韓鳳娟
        中醫(yī)藥信息 2017年5期
        關(guān)鍵詞:小檗癌變睪酮

        劉逸超,付楊,郭瀅,郭琦,韓鳳娟

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.哈爾濱市第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150056;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

        小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜的影響

        劉逸超1,2,付楊1,郭瀅1,郭琦1,韓鳳娟3*

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.哈爾濱市第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150056;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

        目的:探討小檗堿對PCOS模型大鼠血清睪酮、子宮內(nèi)膜相關(guān)基因及蛋白信號的影響。方法:90日齡清潔級SD雌性大鼠根據(jù)Poretsky造模方法皮下注射胰島素及絨毛膜促性腺激素,連續(xù)22日構(gòu)建PCOS模型。小檗堿灌胃治療28日,采用ELISA法檢測睪酮激素水平,采用免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜組織ERα蛋白表達情況,qRT-PCR技術(shù)檢測子宮內(nèi)膜Kras、PTEN mRNA基因表達水平。結(jié)果:與模型組相比,小檗堿組睪酮水平顯著降低(P<0.05);ERα陽性表達率下降(P<0.05);Kras、PTEN mRNA表達水平下降(P<0.05)。結(jié)論:小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜有顯著影響,對激素合成、細胞癌變等信號分子具有調(diào)控作用。

        多囊卵巢綜合征;子宮內(nèi)膜癌;小檗堿

        多囊卵巢綜合征是臨床常見的生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂性疾病,由Stem和Leventhal于1935年首次提出,發(fā)病率約占育齡期婦女的10%,目前研究認為胰島素抵抗和高雄激素血癥可能是PCOS發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變的高危風(fēng)險[1]。研究發(fā)現(xiàn),小檗堿具有與二甲雙胍相似的生物學(xué)行為,可改善胰島素抵抗,同時具有抑制卵巢細胞分泌雄激素水平的作用[2],因此本研究選擇小檗堿作為治療藥物,進一步探討小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜病變的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑

        小檗堿(上??稻呕び邢薰?;二甲雙胍 (Sigma公司);重組人胰島素注射液(禮來蘇州制藥有限公司);注射用人絨毛膜促性腺激素 (麗珠集團麗珠制藥廠);酶聯(lián)免疫吸附試驗睪酮檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司);電化學(xué)發(fā)光試劑盒(Roche公司);兔二步法檢測試劑盒(中杉金橋);ERα(Santa Cruze公司);PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)。

        1.2 實驗方法

        根據(jù)Poretsky法[3]建立PCOS大鼠模型,選取 90日齡 SD 雌性大鼠120只,體質(zhì)量180 g左右。分籠正常飼養(yǎng),正常飲食水,隨機分為:1)對照組30只,每日皮下注射注射用生理鹽水 0.2 ml,連續(xù)注射22日。建模后第23日起每只大鼠給予吐溫-80生理鹽水混合液2 ml灌胃,1次/日,連續(xù)灌胃28日。2)模型組、小檗堿組及二甲雙胍組各30只,采用Poretsky法構(gòu)建PCOS大鼠模型,每只皮下注射HCG 3.0 IU/d;每日皮下注射胰島素,第1日自0.5 IU/d開始,逐漸遞增至6.0 IU/d,并按此劑量維持至第22日。建模第23日起每只大鼠給予吐溫-80生理鹽水混合液2 ml灌胃,每日1次,連續(xù)灌胃28日。藥粉均溶在吐溫-80生理鹽水混合液,以小檗堿200 mg/(kg·d)[4],二甲雙胍300 mg/(kg·d)[5]為灌胃濃度。

        1.3 睪酮水平檢測

        待藥物干預(yù)治療結(jié)束,抽取眼眶靜脈血離心后,檢測血清T水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測睪酮。

        1.4 ERα蛋白檢測

        實驗大鼠斷髓處死后取子宮組織,應(yīng)用免疫組化檢測ERα蛋白表達情況。

        1.5 qRT-PCR技術(shù)檢測mRNA相對表達量

        各組大鼠斷髓處死后取子宮內(nèi)膜組織,應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測PTEN、Kras mRNA 在各組大鼠子宮內(nèi)膜組織基因表達情況。使用SYBR Green PCR Master Mix 進行熒光定量PCR 檢測。檢測反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct) ,求出基因相對內(nèi)參基因β-actin表達量的變化ΔCt,即ΔCt=目的基因Ctmean-內(nèi)參基因Ctmean,計算2-ΔΔCt數(shù)值進行統(tǒng)計比較。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠睪酮水平比較

        模型組與空白組比較,睪酮分別為(339.33±66.41)、(243.04±69.08)pg/ml,差異極顯著(P<0.01)。小檗堿組與模型組比較,睪酮分別為(206.14±14.63)、(339.33±66.41)pg/ml,差異極顯著(P<0.01)。二甲雙胍組與模型組比較,睪酮分別為(250.67±33.23)、(339.33±66.41)pg/ml,差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果見表1。

        表1 各組大鼠睪酮水平比較

        注:與空白組比較,*P<0.01;與模型組比較,△P<0.01。

        2.2 雌激素受體α蛋白在子宮內(nèi)膜的表達情況比較

        模型組與空白組比較,ERα蛋白表達陽性率分別為91.67%、16.67%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。小檗堿組與模型組比較,ERα蛋白表達陽性率分別33.33%、91.67%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍組與模型組比較,ERα蛋白表達陽性率分別為25.00%、91.67%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖1。

        表2 雌激素受體α(ERα)表達[n(%)]

        注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

        圖1 小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜ERα蛋白的影響

        2.3 PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜組織Kras mRNA、PTEN mRNA的表達情況比較

        模型組與空白組比較,Kras mRNA相對表達量分別為(82.915 9±8.836 7)、(1.000 0±0.000 0),t=-20.728,P=0.000。小檗堿組與模型組比較,Kras mRNA相對表達量分別為(12.432 9±1.872 2)、(82.915 9±8.836 7),t=-17.448,P=0.000;二甲雙胍組與模型組比較,Kras mRNA相對表達量分別為(1.397 0±0.406 6)、(82.915 9±8.836 7),t=-20.606,P=0.000。結(jié)果見表3,圖2。

        表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Kras mRNA、PTEN mRNA情況比較

        注:與空白組比較,*P<0.01;與模型組比較,△P<0.01。

        圖2 小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜Kras mRNA的影響

        模型組與空白組比較,PTEN mRNA相對表達量分別為(20.540 9 ±4.701 9)、(1.000 0±0.000 0),t=-9.293,P=0.000。小檗堿組與模型組比較,PTEN mRNA相對表達量分別為(0.168 6±0.264 8)、(20.540 9±4.701 9),t=-9.673,P=0.000;二甲雙胍組與模型組比較,PTEN mRNA相對表達量分別為(0.529 9±0.362 6)、(20.540 9±4.701 9),t=-9.488,P=0.000。結(jié)果見表3,圖3。

        圖3 小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜PTEN mRNA的影響

        3 討論

        多囊卵巢綜合征患者發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變的發(fā)病率逐年升高[6-10],研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜持續(xù)受到雌激素的刺激、高胰島素血癥以及肥胖是促使形成子宮內(nèi)膜癌變的重要因素[11]。Harding等研究發(fā)現(xiàn),在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的影響因素里胰島素抵抗發(fā)揮著非常重要的作用,甚至與因接觸外源性雌激素導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌變的患者相比,胰島素抵抗患者更具有發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變的高危風(fēng)險[12]。Shafiee進行一項回顧性研究評估PCOS患者子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的機制,可能是通過分子級細胞調(diào)控的,胰島素樣生長因子及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的功能被激活,導(dǎo)致胰島素水平升高,通過激活PI3K/AKT及Ras/MAPK信號通路,加速細胞有絲分裂的作用[13]。基因組學(xué)和蛋白組學(xué)已經(jīng)證實在PCOS患者子宮內(nèi)膜組織里胰島素信號傳導(dǎo)通路影響子宮內(nèi)膜癌變的基因和蛋白,其表達均上調(diào)[14]。Savaris研究也指出,過度激活PCOS子宮內(nèi)膜MAPK/ERK信號傳導(dǎo)通路,可以導(dǎo)致PCOS發(fā)生子宮內(nèi)膜病變,而激活MAPK/ERK信號傳導(dǎo)通路是由胰島素抵抗和高胰島素血癥調(diào)控的[15]。

        胰島素增敏劑二甲雙胍通過改善胰島素抵抗,可以逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜的增生,降低PCOS發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變的風(fēng)險。Engelman等研究認為,二甲雙胍作為胰島素增敏劑,通過改善胰島素敏感性,減輕體質(zhì)量,可阻止PCOS患者發(fā)展成子宮內(nèi)膜癌,臨床上可以顯著阻止癌癥細胞的癌變[16]。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)將具有胰島素增敏作用的二甲雙胍作為治療子宮內(nèi)膜癌的參考用藥。動物實驗及臨床試驗已經(jīng)證實,二甲雙胍可以阻止子宮內(nèi)膜增生,在使增生的子宮內(nèi)膜組織恢復(fù)正常的過程中起到積極地調(diào)控作用[17]。

        Hsu等通過研究發(fā)現(xiàn),小檗堿可以改善AKT/PI3K信號通路,改善胰島素信號傳導(dǎo),顯著改善胰島素抵抗[18]。同時小檗堿具有植物性抗癌成分,作為從植物中提取的生物堿,具有廣泛的生物學(xué)活性,可以治療多種疾病。子宮內(nèi)膜病變與雌孕激素長期刺激密切相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可以顯著降低雌激素受體α蛋白的表達,使雌激素的生物學(xué)功能在子宮內(nèi)膜局部的作用降低,減少雌激素對子宮內(nèi)膜的持續(xù)刺激,降低發(fā)生癌變的風(fēng)險。本實驗通過檢測甾體激素水平發(fā)現(xiàn),小檗堿具有降低睪酮水平的作用,并且小檗堿降低雄激素睪酮的療效優(yōu)于二甲雙胍。本實驗為研究PCOS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌變的作用機制,選取原癌基因Kras和抑癌基因PTEN作為研究指標。小檗堿可以使PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜組織Kras和PTEN mRNA表達均下降,與二甲雙胍作用趨勢是一致的。PTEN mRNA表達下降的原因可能是PTEN廣泛影響細胞功能,細胞內(nèi)PTEN表達降低,可能使更多的AKT蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng),使胰島素信號通路發(fā)生變化,PTEN編碼的蛋白具有酪氨酸磷酸化特性,可以負反饋調(diào)節(jié)與癌變相關(guān)的信號通路[19]。因此,小檗堿通過增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗,抑制細胞增殖,對甾體激素合成、細胞增殖、內(nèi)膜癌變等信號分子具有調(diào)控作用,可以防治PCOS發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變。

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        EffectofBerberineontheEndometriaofthePCOSRats

        LIUYi-chao1,2,FUYang1,GUOYing1,GUOQi1,HANFeng-juan3*

        (1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheSecondHospitalofHarbin,Harbin150056China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

        Objective:To explore the influence of Berberine on testosterone level and the expressions of endometrial gene and its protein in rats with polycystic ovarian syndrome (PCOS). Methods:120 female Sprague-Dawley rats of 90 days were made into PCOS models with 22-day subcutaneous injection of insulin and human chorionic gonadotropin(HCG). After modeling, Berberine was given to rats in the next 28 days. The testosterone levels was tested by ELISA method; the protein expression of endometrial estrogen receptor α(Era) was detected with immunohistochemical method; the expression levels of endometrial Kras and PTEN mRNA gene were detected with qRT-PCR technique. Results:Compared to the model group, the testosterone level in Berberine group was significantly decreased(P<0.05); the positive protein expression of Era, and the gene expressions of Kras and PTEN mRNA were significantly reduced in endometrial tissue(P<0.05). Conclusion: Berberine has significant effects on the endometria of PCOS rats, which regulates the hormone synthesis and cell carcinoma.

        Polycystic ovary syndrome(PCOS); Endometrial carcinoma; Berberine

        國家中醫(yī)藥管理局國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項課題(No.JDZX2012038)

        劉逸超(1983-),女,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)婦科學(xué)專業(yè)博士研究生,主治醫(yī)師,主要研究方向:中醫(yī)治療婦科疾病。

        韓鳳娟*(1971-),女,主任醫(yī)師,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向:婦科腫瘤。

        2017-03-15

        修回日期:2017-04-10

        R285.5

        :A

        :1002-2406(2017)05-0016-04

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