彭宏偉，郭麗華

(1.曲阜師范大學(xué)醫(yī)院藥劑科，山東 曲阜 273165； 2.曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東 曲阜 273165)

高效液相色譜法測(cè)定醋制消腫止痛液中苦參堿、氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A的含量Δ

彭宏偉1*，郭麗華2

(1.曲阜師范大學(xué)醫(yī)院藥劑科，山東 曲阜 273165； 2.曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東 曲阜 273165)

目的：建立醋制消腫止痛液中苦參堿、氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Sinochrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速為1.0 ml/min；柱溫為30 ℃。測(cè)定苦參堿、氧化苦參堿采用流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸水(V∶V=92∶8)，用三乙胺調(diào)pH至6.0，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；測(cè)定羥基紅花黃色素A采用流動(dòng)相乙腈-0.2%甲酸水(V∶V=15∶85)，檢測(cè)波長(zhǎng)為403 nm。結(jié)果：苦參堿、氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A的進(jìn)樣量分別在0.412～1.648、0.448～1.792、0.220～0.880 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線(xiàn)性關(guān)系(r分別為0.999 5、0.999 3、0.999 4)；苦參堿的平均加樣回收率為98.90%，RSD為0.42%；氧化苦參堿的平均加樣回收率為99.08%，RSD為0.69%；羥基紅花黃色素A的平均加樣回收率為99.03%，RSD為0.44%。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性良好，可作為該制劑的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，并為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

高效液相色譜法； 醋制消腫止痛液； 苦參堿； 氧化苦參堿； 羥基紅花黃色素A； 含量

醋制消腫止痛液主要由苦參、紅花、車(chē)前草、蒲公英、川椒等7味中藥組成，具有散寒止痛、祛風(fēng)除濕、溫通筋絡(luò)、活血化瘀的功效，可用于證屬淤滯型或風(fēng)寒濕型的各種急、慢性閉合性軟組織損傷，關(guān)節(jié)扭傷，腰肌勞損及肩周炎等的治療?？鄥榉街芯?，有清熱利濕、祛風(fēng)殺蟲(chóng)、解毒等功效[1]。現(xiàn)代研究結(jié)果表明，苦參的化學(xué)成分主要為生物堿和黃酮類(lèi)[2-3]，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗變態(tài)反應(yīng)、抗腫瘤等多種藥理活性[4-7]。紅花為方中臣藥，具有活血通經(jīng)的功效，羥基紅花黃色素A為其主要活性成分[8-9]。為有效控制醋制消腫止痛液的質(zhì)量，本研究建立了高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測(cè)定該制劑中苦參堿、氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A的含量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 infinity液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；KQ-3200DE型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；OHAUS-CP214型分析天平(奧豪斯儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

苦參堿對(duì)照品(批號(hào)：110805-200508)、氧化苦參堿對(duì)照品(批號(hào)：110780-201508)、羥基紅花黃色素A對(duì)照品(批號(hào)：111637-201609)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；醋制消腫止痛液樣品(批準(zhǔn)文號(hào)：魯藥制字Z20130037，批號(hào)：20160510)；乙腈為色譜純(天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；水為雙蒸水(化學(xué)與化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

(1)苦參堿與氧化苦參堿的測(cè)定色譜條件：色譜柱為Sinochrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水(V∶V=92∶8)，用三乙胺調(diào)pH至6.0；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 ml/min。理論塔板數(shù)按苦參堿與氧化苦參堿峰計(jì)應(yīng)≥3 000。(2)羥基紅花黃色素A的測(cè)定色譜條件：色譜柱為Sinochrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸水(V∶V=15∶85)；檢測(cè)波長(zhǎng)為403 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 ml/min。理論塔板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)應(yīng)≥3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

(1)精密稱(chēng)取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品適量，加甲醇溶解制得苦參堿1.03 mg/ml和氧化苦參堿1.12 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取1 ml定容至10 ml容量瓶中，制得對(duì)照品溶液。(2)精密稱(chēng)取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，加甲醇制

成羥基紅花黃色素A 0.55 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取1 ml定容至10 ml容量瓶中，制得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

(1)量取本品適量，蒸干，研細(xì)，精密稱(chēng)取1.0 g，置于100 ml錐形瓶中，加水50 ml，超聲處理10 min，氨試液調(diào)pH至10，分別用三氯甲烷30、25、20 ml萃取，合并三氯甲烷層，濾過(guò)，濾液蒸干，加甲醇使溶解，定容至10 ml容量瓶中，混勻，再取1 ml定容至10 ml容量瓶中，混勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。(2)量取本品適量，蒸干，研細(xì)，精密稱(chēng)取1.0 g，置于100 ml錐形瓶中，加甲醇50 ml，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加甲醇使溶解，定容至10 ml容量瓶中，混勻，再取1 ml定容至10 ml容量瓶中，混勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

(1)取苦參以外的其余藥味，制得不含苦參的空白制劑，照“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得陰性對(duì)照溶液1。(2)取紅花以外的其余藥味，制得不含紅花的空白制劑，照“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得陰性對(duì)照溶液2。

2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品溶液中苦參堿、氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A色譜峰能達(dá)到基線(xiàn)分離，且保留時(shí)間與對(duì)照品保持一致；陰性對(duì)照溶液在對(duì)應(yīng)保留時(shí)間附近無(wú)干擾峰，溶劑峰亦無(wú)干擾，表明其余藥味對(duì)苦參堿、氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A的測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

A.苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品；B.苦參堿和氧化苦參堿供試品；C.陰性對(duì)照溶液1；D.羥基紅花黃色素A對(duì)照品；E.羥基紅花黃色素A供試品；F.陰性對(duì)照溶液2A.standard solution of matrine and oxymatrine; B.sample solution of matrine and oxymatrine; C.negative control solution one; D.standard solution of hydroxy safflower yellow A; E.sample solution of hydroxy safflower yellow A; F.negative control solution two圖1 HPLC圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密量取苦參堿和氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 ml，加甲醇定容至10 ml容量瓶中；分別精密量取羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 ml，加甲醇定容至10 ml容量瓶中。精密吸取上述質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μl，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X，μg)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，苦參堿進(jìn)樣量在0.412～1.648 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=67.39X-19.84，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5；氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.448～1.792 μg范圍呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=66.91X-62.95，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3；羥基紅花黃色素A進(jìn)樣量在0.22～0.88 μg范圍呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=59.61X-6.21，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4。

2.7 精密度考察

精密吸取苦參堿和氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液各10 μl，按上述色譜條件，重復(fù)測(cè)定6次，記錄峰面積積分值。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A峰面積RSD分別為0.52%、1.18%、0.79%，表明精密度良好。

2.8 重現(xiàn)性考察

精密稱(chēng)取同一批樣品共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，苦參堿的平均含量為4.64 mg/g，氧化苦參堿的平均含量為0.56 mg/g，羥基紅花黃色素A的平均含量為1.427 mg/g，RSD分別為0.46%、0.86%、0.65%。

2.9 穩(wěn)定性考察

精密吸取苦參堿和氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A供試品溶液各10 μl，分別在4、8、12、16、20、24、36 h注入液相色譜儀，依法測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A的RSD分別為0.44%、0.40%、0.39%，表明樣品供試液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量苦參堿(4.64 mg/g)、氧化苦參堿(0.56 mg/g)、羥基紅花黃色素A(1.427 mg/g)的同一批樣品6份，分別精密加入5 ml苦參堿對(duì)照品溶液(0.103 mg/ml)、氧化苦參堿對(duì)照品溶液(0.112 mg/ml)、羥基紅花黃色素A(0.055 mg/ml)，按“2.3”項(xiàng)下制備，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1—3。

表1 苦參堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Recovery test of matrine

表2 氧化苦參堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Recovery test of oxymatrine

表3 羥基紅花黃色素A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Recovery test of hydroxy safflower yellow A

3 討論

在樣品溶液制備過(guò)程中，室溫(25 ℃)下直接用三氯甲烷萃取時(shí)，乳化現(xiàn)象非常嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)中嘗試加少量甲醇、加熱等方法破乳效果不明顯。將藥液放置于10 ℃下2 h，再進(jìn)行萃取操作，乳化基本消失。

取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液經(jīng)TU-1 901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示，苦參堿和氧化苦參堿分別在204和206 nm處有最大吸收。但在此波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，甲醇溶劑峰干擾較多，基線(xiàn)不穩(wěn)定。分別有選擇225[10]、208[11]、210[12]、220 nm[13]波長(zhǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)過(guò)比較，本研究最終選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，此波長(zhǎng)下干擾少，基線(xiàn)穩(wěn)定，重復(fù)性好，且吸收度合適。

對(duì)于色譜柱的選擇，文獻(xiàn)多采用氨基柱[14]、C18柱[15]，本研究選用ODS-BP柱。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)篩選，最終選擇乙腈-0.2%磷酸溶液(V∶V=92∶8)用三乙胺調(diào)pH至6.0為流動(dòng)相，目標(biāo)峰峰形較好，拖尾有很好改善，理論板數(shù)較高。

羥基紅花黃色素A含量測(cè)定方面，本研究采用乙腈-0.2%甲酸水(V∶V=15∶85)為流動(dòng)相，目標(biāo)峰能很好分離，但未見(jiàn)報(bào)道，可為羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定提供新的依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定方法結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于醋制消腫止痛液中苦參堿與氧化苦參堿、羥基紅花黃色素A含量的測(cè)定，也為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

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Content Determination of Matrine,Oxymatrine and Hydroxy Safflower Yellow A Contents in Xiaozhongzhitong Vinegar Liquid by HPLCΔ

PENG Hongwei1,GUO Lihua2

(1.Dept.of Pharmacy，Qufu Normal University Hospital，Shandong Qufu 273165,China； 2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Qufu Normal University,Shandong Qufu 273165,China)

OBJECTIVE: To establish the method for content determination method of matrine,oxymatrine and hydroxy safflower yellow A contents in Xiaozhongzhitong vinegar liquid by HPLC. METHODS: HPLC method was adopted,the column was Sinochrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm，5 μm),with flow rate of 1.0 ml/min and column temperature of 30 ℃. Matrine and oxymatrine were determined by mobile phase acetonitrile 0.2% and phosphoric acid water(V∶V=92∶8). Triethylamine was used to adjust PH value to 6.0,and the wave length was 220 nm. Hydroxy safflower yellow A was determined with mobile phase of acetonitrile 0.2% methanoic acid water(V∶V=15∶85) and detection wavelength of 403 nm. RESULTS: The calibration curves were linear when the sample ranges of matrine,oxymatrine and hydroxy safflower yellow A were at 0.412-1.648 μg,0.448-1.792 μg and 0.22-0.88 μg,respectively(r=0.999 5,r=0.999 3 andr=0.999 4). The average recovery rate andRSDof matrine was at 98.90% and 0.42%,oxymatrine was at 99.08% and 0.69%,and hydroxy safflower yellow A was at 99.03% and 0.44%. CONCLUSIONS: This method is simple,rapid,accurate and suitable for the detection of quality of Xiaozhongzhitong liquid,which can provide the theoretical basis for the development and application of Xiaozhongzhitong vinegar liquid.

HPLC; Xiaozhongzhitong vinegar liquid; Matrine; Oxymatrine; Hydroxy safflower yellow A; Content

2014曲阜師范大學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.xkj201416)

R927.2

A

1672-2124(2017)08-1039-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.012

2017-03-17)

*主管藥師，碩士。研究方向：中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：phw04463833@163.com