李穎，張五星，周偉，王學(xué)軍

（1.河北北方學(xué)院 研究生部，河北 張家口 075061；2.中國人民解放軍第309醫(yī)院 腎臟內(nèi)科，北京 100091；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

丁型肝炎病毒復(fù)制包裝載體的構(gòu)建*

李穎1，張五星2，周偉2，王學(xué)軍3

（1.河北北方學(xué)院 研究生部，河北 張家口 075061；2.中國人民解放軍第309醫(yī)院 腎臟內(nèi)科，北京 100091；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

目的 構(gòu)建一種可以實現(xiàn)丁型肝炎病毒（HDV）復(fù)制包裝的HDV轉(zhuǎn)座子載體。方法 采用分子克隆方法構(gòu)建含HDV復(fù)制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表達(dá)框的轉(zhuǎn)座子（PB）載體PB126I3，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞上清用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測HBsAg的表達(dá)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞8.5 d后提取病毒用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測HDV核糖核酸（RNA）的含量；同時細(xì)胞上清病毒濃縮后感染HBV受體鈉離子/?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+/NTCP）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.N9細(xì)胞系并于感染后第7天用免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)HDVδ抗原的表達(dá)。結(jié)果 HDV復(fù)制包裝載體PB126I3瞬時轉(zhuǎn)染HuH-7后細(xì)胞上清可檢測到HBsAg的表達(dá)和較高滴度的HDV顆粒，并且該病毒顆粒感染HepG2.N9細(xì)胞7 d后細(xì)胞內(nèi)可檢測到HDVδ抗原。結(jié)論 HDV復(fù)制包裝轉(zhuǎn)座子載體構(gòu)建成功，為未來HDV的大規(guī)模復(fù)制包裝以及嘗試建立HDV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系提供前期基礎(chǔ)。

丁型肝炎病毒；載體構(gòu)建；復(fù)制；包裝；瞬時轉(zhuǎn)染

丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）是一種缺陷核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）病毒，其包裝分泌和傳播需要乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的幫助，與單獨(dú)HBV感染相比，HBV與HDV共同感染后會導(dǎo)致肝硬化的速度加快，并使暴發(fā)性肝炎和肝細(xì)胞癌的發(fā)生率提高[1-3]。我國是乙型病毒性肝炎患病大國，與HBV比較，目前缺乏對HDV的全面了解，加強(qiáng)對HDV的深入研究很有必要。

目前HDV的獲取方式只有2種：一種是從丁型肝炎患者的血清中直接提取HDV，但是我國丁型肝炎的患者比較少見，若想依賴從血清中直接提取HDV的這種途徑不是很理想；另外一種是基于質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HuH-7肝癌細(xì)胞系的HDV包裝方法[4]。本研究嘗試建立含有HDV復(fù)制子和我國HBV流行株C基因型表面抗原表達(dá)框的HDV表達(dá)載體，實現(xiàn)體外大規(guī)模包裝，為進(jìn)一步研究HDV感染復(fù)制特性提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

JC126載體（T JOHN 教授饋贈），pHBV1.31（C基因型）（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所構(gòu)建并保存[5]），PB513B-1載體（購自美國System Biosciences公司），HuH-7細(xì)胞（購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫），HepG2細(xì)胞（購自美國ATCC公司），HepG2.N9細(xì)胞（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)實驗室構(gòu)建并保存[6]），含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（購自澳大利亞 Bovogen公司），大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司），限制性內(nèi)切酶DNaseI（購自美國NEB公司），DNA快速連接試劑盒（D6022）、TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0、Prime ScriptTMRT Master Mix（perfect real time）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH plus）及DNA marker DL15000（均購自日本TaKaRa公司），體外轉(zhuǎn)染試劑Gen JetTMVerⅡ（美國SignaGen公司產(chǎn)品），DMEM、MEM、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胰酶及雙抗（青霉素 -鏈霉素）等（購自北京中科邁晨科技有限公司），Williams E培養(yǎng)基、驢抗兔Alexa FluorTM594標(biāo)記二抗及Slow Fade Gold Antifade Mountant with DAPI（購自美國InvitrogenTM公司），兔抗人丁型肝炎病毒δ抗原多克隆抗體由北京澤溪源有限公司制備，引物合成和質(zhì)粒測序由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司提供服務(wù)。

1.2 方法

1.2.1 含HDV復(fù)制子的PB轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建按常規(guī)分子生物學(xué)方法操作：以含1.1倍HDV復(fù)制子的JC126載體為模板，用引物JC126，正向引物：5-'CACCAATTGATCCTCTAGAGTCGACCCCA-3'，反向引物：5-'GTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACC AAG-3'。擴(kuò)增HDV復(fù)制子片段，然后經(jīng)MfeⅠ-HF和BamHⅠ-HF雙酶切后插入線性化的PB513B-1載體（經(jīng)EcoRⅠ-HF和BamHⅠ-HF雙酶切）得到PB126載體；PB126載體依次用NotI-HF和BamHⅠ-HF酶切，然后與含HBV表面抗原表達(dá)框的片段（pHBV1.31經(jīng)BglⅡ和NotⅠ-HF雙酶切后回收的約2 800 bp大小片段）相連接得到目標(biāo)載體PB126I3。質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定正確后用于下一步實驗。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞 從液氮罐中取出HuH-7細(xì)胞，37℃快速解凍，離心后用含10%FBS的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳CO2的孵箱。2 d后觀察細(xì)胞貼壁且融合程度達(dá)到80%，此時細(xì)胞生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期，將其消化并接種于24孔板或10 cm皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁且融合程度達(dá)到70%～80%后，用Gen JetTMVerⅡ體外轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.2.3 觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP） 的 表 達(dá) 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染HuH-7細(xì)胞48 h后，用普通熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)確定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是否成功并粗略估計質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 ELISA檢測細(xì)胞上清乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface，HBsAg）的表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后收集細(xì)胞上清用HBsAg檢測試劑盒進(jìn)行ELISA檢測。細(xì)胞上清稀釋5倍取75μl加入檢測HBsAg的96孔板中，并取試劑盒中的陽性對照和陰性對照各75μl作為對照組，用封片紙覆蓋后，放入37℃的孵育箱中孵育60 min；取出反應(yīng)板，向每孔中加入50μl試劑盒中的HBsAg酶結(jié)合物，手工輕輕震蕩10 s；用封片紙覆蓋后，放入37℃的孵育箱中孵育30 min；取出反應(yīng)板，撕去封片紙，洗滌反應(yīng)板5次，在干凈的吸水紙上拍干；洗滌結(jié)束后，立即向每個孔中加入50μl的顯色劑A和50μl的顯色劑B，混勻；手工輕輕震蕩10 s；用封片紙覆蓋后，放入37℃的孵育箱中孵育30 min；向每個孔中加入50μl的終止液，震蕩5 s混勻后；用酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長450 nm，若需扣除顯色劑空白，則先用顯色劑空白對照孔校零，然后讀取各孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定HDV滴度 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞第8.5天收集細(xì)胞上清并用0.45μm濾器過濾去除細(xì)胞碎片后，用DNaseⅠ在37℃消化1 h，然后用TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0提取上清液中的HDV RNA，通過Prime Script?RT Master Mix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complemen tary deoxyribonucleic acid，cDNA），然后通過 qRTPCR測定HDV滴度，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ檢測HDV RNA的拷貝數(shù)（HDV正向引物：5'-GGACC CCTTCAGCGAACA-3'；HDV 反向引物：5'-CCTAGC ATCTCCTCCTATCGCTAT-3'）。

1.2.6 HDV病毒濃縮 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞第8.5天后收集細(xì)胞上清液，用0.45μm濾器過濾收集的病毒液以去除細(xì)胞碎片，按體積比4∶1比例加入25%聚乙二醇 8 000（polyethylene glycol，PEG)，混勻后放于4℃冰箱沉淀過夜，隨后4℃條件下12 000 r/min離心40 min，棄上清液，再離心5 min并徹底吸棄上清液，加入一定體積DMEM或Williams E培養(yǎng)基溶解沉淀，分裝并置于80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 HDV病毒感染性檢測 將生長狀態(tài)良好的HepG2和HepG2.N9細(xì)胞消化后置共聚焦用培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后培養(yǎng)基更換為含有2%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），18μg/ml氫化可的松，40 ng/ml地塞米松，10 ng/ml EGF，5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，3μg/ml胰島素，2 mmol L-谷氨酰胺，5 ng/ml亞硒酸鈉，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Williams E完全培養(yǎng)基并培養(yǎng)48 h，然后用含4%PEG 8000和500拷貝/細(xì)胞的HDV病毒W(wǎng)illiams E完全培養(yǎng)基在37℃感染16 h。感染后每48 h更換1次Williams E完全培養(yǎng)基。感染后第7天用免疫熒光檢測HDVδ抗原的表達(dá)。

1.2.8 免疫熒光方法檢測HDVδ抗原 HDV感染細(xì)胞第7天后用PBS清洗細(xì)胞3遍，加入500μl 4%多聚甲醛固定15min；PBS清洗3遍，加入500μl 0.5%TritonX-100溶液進(jìn)行常溫透膜處理15 min；PBS清洗3遍，加入（2%BSA+5%山羊血清+PBS）混合溶液室溫孵育30 min進(jìn)行封閉；PBS清洗3遍，加入一抗孵育，4℃冰箱過夜；37℃復(fù)溫10 min，PBS清洗3遍，加入二抗孵育，常溫避光1 h；PBS清洗5遍，加入DAPI復(fù)染3～5 min；PBS清洗3遍，置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 6作圖軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含HDV復(fù)制子的PB轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒成功構(gòu)建

原載體SBI513B-1、重組載體PB126和PB126I3經(jīng)BamHⅠ-HF單酶切后跑膠，大小與預(yù)期一致。經(jīng)進(jìn)一步的測序驗證，PB126I3載體構(gòu)建成功。該載體采用轉(zhuǎn)座子載體，啟動子為CMV，啟動子下游為HDV復(fù)制子表達(dá)框和乙肝表面蛋白表達(dá)框；另外該載體還含有eGFP和嘌呤霉素基因，方便轉(zhuǎn)染效率的觀察和后續(xù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選。見圖1～3。

2.2 HDV轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光蛋白的表達(dá)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞有綠色熒光的表達(dá)且亮度較好，轉(zhuǎn)染效率在50%左右，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功（見圖4）。

2.3 細(xì)胞上清HBsAg定性檢測結(jié)果

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞48 h后，轉(zhuǎn)染PB126I3質(zhì)粒的細(xì)胞上清即可檢測到較高水平HBsAg的表達(dá)，為HDV的包裝分泌以及感染傳播提供必要的HBV表面蛋白（見圖5）。

2.4 細(xì)胞上清可檢測到較高滴度的HDV RNA

圖1 重組載體酶切鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞8.5 d后取細(xì)胞上清經(jīng)DNaseⅠ消化后提取病毒檢測HDV RNA的含量，HuH-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染PB126I3載體后細(xì)胞上清可檢測到較高滴度的HDV RNA，而轉(zhuǎn)染PB126載體的HuH-7細(xì)胞上清HDV RNA非常低，說明HuH-7轉(zhuǎn)染PB126I3組HDV被包裝分泌出來，但該HDV顆粒是否具有感染性尚需要進(jìn)一步驗證（見圖6）。

圖2 PB126I3載體測序代表性圖譜

圖3 PB126I3的載體示意圖

圖4 熒光顯微鏡定性觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)

圖5 細(xì)胞上清HBsAg的表達(dá) （稀釋×5）

圖6 細(xì)胞上清HDV RNA含量

2.5 瞬時轉(zhuǎn)染所包裝分泌的HDV病毒體外具有感染性

通過免疫熒光檢測HDV感染HepG2和HepG2.N9細(xì)胞7 d后細(xì)胞內(nèi)HDVδ抗原的表達(dá)，HDV可特異性地感染表達(dá)HBV受體NTCP的HepG2.N9細(xì)胞，證明細(xì)胞上清濃縮液中含有感染性HDV病毒顆粒（見圖7）。

圖7 HDV病毒感染細(xì)胞后HDVδ抗原的表達(dá)

3 討論

HDV為HBV的衛(wèi)星病毒，其感染肝細(xì)胞、在肝細(xì)胞中包裝、釋放出肝細(xì)胞及再感染其他肝細(xì)胞均需要HBsAg的幫助，所以HDV的包裝分泌只能在有HBsAg表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行，體外包裝亦需要HDV和編碼HBsAg包膜蛋白的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞[7-10]。自20世紀(jì)90年代初以來，已經(jīng)開發(fā)不同的基于cDNA或無cDNA的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)用于HDV復(fù)制的體外研究，尤其是由M Y KUO等人[11]構(gòu)建的HDV全基因組三聚體pSVLD3重組質(zhì)粒被廣泛應(yīng)用于各種HDV的實驗中。

本實驗在國內(nèi)外研究基礎(chǔ)上成功構(gòu)建HDV復(fù)制包裝轉(zhuǎn)座子載體，其含有1.1倍HDV基因組和HBV中國流行株C基因型的HBsAg表達(dá)框，該載體經(jīng)體外轉(zhuǎn)染HuH-7肝癌細(xì)胞成功實現(xiàn)HDV體外的復(fù)制包裝，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞上清含有較高滴度的HDV病毒顆粒。

近年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，Na+/NTCP）是HBV和HDV的重要受體，將NTCP導(dǎo)入HepG2、HuH7等人類肝癌細(xì)胞系可實現(xiàn)HBV/HDV的感染復(fù)制，極大地改善實驗的可重復(fù)性[12-13]，本實驗室前期成功構(gòu)建NTCP的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HepG2.N9[6]。本研究應(yīng)用該細(xì)胞系成功證明利用本文所構(gòu)建載體包裝分泌的HDV顆粒體外可以有效感染HepG2.N9細(xì)胞，證實所包裝HDV的體外感染性。該載體的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究HDV感染、復(fù)制等特性提供前期技術(shù)基礎(chǔ)。

不過應(yīng)該考慮到利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)生產(chǎn)HDV的方法工作量大，實驗批次之間的可重復(fù)性不夠理想。另外以往研究發(fā)現(xiàn)，HDV復(fù)制對細(xì)胞有毒性[14]，到目前為止尚沒有一種支持HDV穩(wěn)定復(fù)制包裝的細(xì)胞系，簡單有效地實現(xiàn)HDV的大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)還是尚未解決的難題。最近，廈門大學(xué)發(fā)表基于腺病毒的HDV病毒包裝新方法，解決了一定的問題[15]，較早的研究亦發(fā)現(xiàn)，HDV可在特定細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)[16]。雖然該前期研究結(jié)果比較矛盾，但推測通過體外篩選不同的細(xì)胞系有可能實現(xiàn)HDV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立，用于HDV的大規(guī)模生產(chǎn)和抗HDV病毒潛在藥物評價，而本文所構(gòu)建的HDV復(fù)制包裝轉(zhuǎn)座子載體為未來HDV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系建立提供前期基礎(chǔ)和有力保障。

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Construction of hepatitis D virus replication vector*

Ying Li1,Wu-Xing Zhang2,Wei Zhou2,Xue-Jun Wang3
(1.Graduate Faculty,Hebei Northern College,Zhangjiakou,Hebei 075061,China;2.Department of Nephrology,the 309th Hospital of PLA,Beijing,100091,China;3.Institute of Radiation Medicine,Military Academy of Medical Sciences,Beijing,100850,China)

ObjectiveTo construct a transposon vector for hepatitis D virus(HDV)replication and packaging.MethodsThe piggyBac(PB)transposon vector PB126I3 containing HDV replicon and hepatitis B virus surface antigen (HBsAg)expression cassette was constructed by using standard molecular cloning methods.HuH-7 cells were transfected with the vector PB126I3.The expression of green fluorescent protein(GFP)was observed by fluorescence microscopy,and the HBsAg expression level in cell medium was detected by ELISA 48 hours after transfection.HDV RNA in cell supernatants was extracted and detected by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)8.5 days after transfection.Meanwhile,HDV particles in cell medium were concentrated and infected the HepG2.N9 cells which were stably transfected with HBV receptor NTCP.The cellular expression of HDV δ antigen was detected by immunofluorescence 7 days after infection.ResultsHuH-7 cells were successfully transfected by the vector PB126I3,and secreted a large number of HBsAg and HDV particles in cell medium.HDV δ antigen was detected obviously in HepG2.N9 cells 7 days after HDV infection.ConclusionsHDV replicon vector PB126I3 were successfully constructed for HDV replication and packaging,which will promote the large-scale of HDV production and HDV transgenic hepatocyte cell line establishment in the future.

hepatitis D virus;vector construction;replication;packaging;transient transfection

R516.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.006

1005-8982（2017）11-0031-05

2017-03-03

國家863青年科學(xué)家項目（No：2015AA020946）；北京市科技新星項目（No：Z171100001117119）

王學(xué)軍，E-mail：xjwang@bmi.ac.cn