徐晨 苗林 陳麗娟 陳輝

·臨床研究·

糖尿病視網(wǎng)膜病變者房水及玻璃體中TF、VEGF的定量檢測(cè)及分析

徐晨 苗林 陳麗娟 陳輝

目的 測(cè)定糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)患者房水及玻璃體中的組織因子(TF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的濃度及與DR程度的相關(guān)性。方法 病例組選取2014年1月至2015年12月上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院眼科住院就診的擬行白內(nèi)障手術(shù)及玻璃體切除聯(lián)合白內(nèi)障手術(shù)的2型糖尿病患者。共分為5組，正常對(duì)照組(A組)、糖尿病患者無(wú)視網(wǎng)膜病變組 (B組)、DR組 (C組)，增生型DR組 (D組),玻璃體對(duì)照組(E組)。收集A、B、C、D組房水標(biāo)本、D、E組玻璃體標(biāo)本。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法定量檢測(cè)房水及玻璃體中TF和VEGF含量。結(jié)果 房水中的TF與VEGF濃度隨著DR的不同程度呈增高的趨勢(shì)，在增生型DR病變組TF與VEGF濃度明顯增高(P<0.001)，該組患者玻璃體TF與VEGF含量明顯增高，與玻璃體對(duì)照組(E組)比較有顯著性差異(P<0.001)。各組中房水及玻璃體中的VEGF與TF二者有顯著正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 TF和VEGF高表達(dá)可能在DR病程進(jìn)展及病情嚴(yán)重程度中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。

組織因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；糖尿病性視網(wǎng)膜病變；房水；玻璃體

[臨床眼科雜志，2017，25：302]

[J Clin Ophthalmol,2017,25:302]

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，是糖尿病患者致盲的重要原因。其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。DR在病理學(xué)上屬于一種細(xì)胞增殖性疾病，其發(fā)生、發(fā)展必然與細(xì)胞增殖的調(diào)控失常有關(guān)。細(xì)胞因子在細(xì)胞增殖的調(diào)控中起重要作用，參與視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)受損。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)組織因子(tissue factor, TF) 即凝血因子Ⅲ，具有血管新生，信號(hào)傳導(dǎo)受體的功能等多種病理、生理過(guò)程[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是最重要的生長(zhǎng)因子, 其作用有誘導(dǎo)增加血管的通透性，新生血管的生成。因此，我們研究DR患者眼內(nèi)液TF和VEGF定量分析，以探討兩者在DR發(fā)展變化中的作用。

資料與方法

一、對(duì)象

選取2014年1月至2015年12月上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院眼科住院就診的擬行白內(nèi)障手術(shù)及玻璃體切除聯(lián)合白內(nèi)障手術(shù)的2型糖尿病患者，對(duì)所有患者進(jìn)行充分散瞳后詳細(xì)檢查眼底，并拍攝眼底彩色照相，部分可疑患者做熒光素鈉眼底血管造影(術(shù)前因晶狀體混濁看不清眼底的患者，于術(shù)后l周進(jìn)行眼底檢查)確定被檢者有無(wú)DR，玻璃體大量積血無(wú)法窺清眼底者行眼部B型超聲檢查。研究對(duì)象共50例，分組為A組：正常對(duì)照組，共10例(男性5例，女性5例)，平均年齡(66.2±8.88)歲。 B組：無(wú)DR組(non diabetic retinopathy,NDR)：共10例(男性6例，女性4例)，平均年齡(64.3±3.24)歲。C組：非增生性DR組(non proliferative diabetic retinopathy,NPDR)：共10例(男性6例，女性4例)，平均年齡(63.7±6.15)歲。D組：增生性DR組(proliferative diabetic retinopathy,PDR)：共10例(男性6例，女性4例)，平均年齡(66.4±3.2)歲。E組：玻璃體對(duì)照組為單純黃斑裂孔或外傷等不伴有增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)患者(D組)：共10例(男性6例，女性4例) ，平均年齡(65.4±4.3)歲。

二、方法

對(duì)所有研究對(duì)象收集房水標(biāo)本及玻璃體標(biāo)本。標(biāo)本采集：開瞼后以0.5 g/L碘伏稀釋液消毒結(jié)膜囊，無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗，無(wú)菌紗布吸盡結(jié)膜囊中殘液。0.45 mm針頭接l ml針管刺入前房緩慢抽取房水約100～200 μl，立即注入0.5 ml無(wú)菌Eppendorf管中。在玻璃體腔灌注前由睫狀體平坦部抽取玻璃體液樣本，約0.2 ml標(biāo)本移至已消毒并硅化的0.5 ml Eppendorf管。在管外部標(biāo)注好所取患者的住院號(hào)，置-80 ℃冰箱備用，測(cè)定前室溫復(fù)融。人TF和VEGF定量測(cè)定均采用雙抗體夾心ELISA法，人TF、VEGF ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

A、B、C、D四組房水中TF水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=289.82,P<0.001)。四組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，B組 vs. A組，P=0.024; C組 vs. B組，P=0.014；其余比較，均有P<0.001(表1)。實(shí)驗(yàn)組D組玻璃體與E組比較， D組玻璃體TF水平明顯高于E組，有顯著性差異(t=47.01,P<0.001)(表1) 。

表1 各組房水及玻璃體中TF水平比較

a：與A組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；b：與B組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；c：與C組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*：差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E組 vs. D組，t=47.01,P<0.001

A、B、C、D四組房水中VEGF水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1159.53,P<0.001)。四組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均有P<0.001(表2)。D組玻璃體與E組比較， D組玻璃體VEGF水平明顯高于E組，有顯著性差異(t=55.75,P<0.001)(表2)。

表2 各組房水及玻璃體中VEGF水平比較

a：與A組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；b：與B組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；c：與C組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E組 vs. D組，t=55.75,P<0.001

房水中TF、VEGF濃度隨著糖尿病患者眼底病變嚴(yán)重程度呈明顯同向增高趨勢(shì)。房水VEGF與TF二者有顯著正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。2組玻璃體中TF與VEGF二者有顯著正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

圖1 各組房水中TF與VEGF相關(guān)性

圖2 2組玻璃體中TF與VEGF相關(guān)性

討 論

DR是糖尿病最為常見和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是糖尿病代謝紊亂和內(nèi)分泌系統(tǒng)與血液系統(tǒng)損害在視網(wǎng)膜上的反映，其發(fā)病率隨糖尿病病程的發(fā)展而增高，5年內(nèi)DR發(fā)生率為44.4%，7年后為56%[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì) DR的認(rèn)識(shí)也不斷深入，大量研究表明，多種基因及因子參與此過(guò)程如VEGF,色素上皮衍生因子(PEDF)、TF、腫瘤壞死因子。還有很多與DR相關(guān)因子的作用機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)、闡明，使我們對(duì)DR的認(rèn)識(shí)逐步加深。

正常情況下眼部組織如結(jié)膜、葡萄膜、視網(wǎng)膜等不表達(dá)組織因子[2，3]，但組織因子在脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞及其瘤組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá),在翼狀胬肉組織的基底細(xì)胞、深層細(xì)胞及淺表上皮細(xì)胞中也有表達(dá)[4]。

TF通過(guò)凝血途徑產(chǎn)生凝血酶。凝血酶可通過(guò)水解跨膜PARs，不依賴血液凝結(jié)而誘導(dǎo)血管形成。凝血酶激活的PARs可使許多與血管形成的基因包括TF、VEGF、及bFGF與MMP-2的活性上調(diào)。這些基因可觸發(fā)多種反應(yīng)如內(nèi)皮細(xì)胞形狀改變、血管滲透性增高可觸發(fā)多種反應(yīng)如內(nèi)皮細(xì)胞形狀改變、血管滲透性增高等[5，6]。組織因子啟動(dòng)凝血后生成的凝血酶可促進(jìn)活化的血小板(VEGF運(yùn)載體)釋放VEGF，VEGF也能上調(diào)TF[7]，TF胞質(zhì)區(qū)具有顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成VEGF的作用，VEGF也可促進(jìn)TF的表達(dá)；當(dāng)TF與FⅦa結(jié)合后激活TF細(xì)胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶，引起第二信使Ca2+內(nèi)流，通過(guò)MAPK或PKC途徑信號(hào)傳導(dǎo)引起VEGF轉(zhuǎn)錄的增加。TF胞內(nèi)區(qū)末端3個(gè)絲氨酸殘基的磷酸化是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵所在，這種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是PKC依賴性的。TF胞內(nèi)區(qū)的基因突變后上述作用消失，但胞外區(qū)的基因突變后對(duì)上述作用無(wú)影響[8-10]。血管壁損傷及缺血、缺氧可使內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織因子而促進(jìn)凝血及血管新生，缺氧還可直接引起組織因子蛋白水平和組織因子活性的增加[11]。

正常情況下RPE、視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和Müller細(xì)胞均存在較低水平的VEGF，用以維持血管穩(wěn)定性和視網(wǎng)膜的正常發(fā)育[12]。通過(guò)激活蛋白激酶C，誘導(dǎo)緊密連接蛋白Occludin磷酸化，Occludin數(shù)量明顯減少，視網(wǎng)膜血管通透性增加[13]；促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和細(xì)胞的黏附，改變內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)某些基因的激活狀態(tài) ,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)變性, 允許和支持新生血管和基質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)向生長(zhǎng)，有助于血管生長(zhǎng)[14]；還可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞間黏附分子-1，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)白細(xì)胞的淤滯和BRB破壞，形成白細(xì)胞栓子, 激活白細(xì)胞釋放多種活性物質(zhì)如氧自由基、溶酶體酶等,引起血流緩慢和血栓形成,導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部缺血加重和新生血管形成[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中各組房水中VEGF和TF顯著相關(guān)。玻璃體中TF與VEGF二者明顯正相關(guān)性。生長(zhǎng)因子TF和VEGF等在DR的病理過(guò)程中具有重要地位，并且兩者之間存在相互作用，共同導(dǎo)致了視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。有必要對(duì)TF進(jìn)行更深入的研究。有助于揭示DR的發(fā)病機(jī)制，為臨床找到更有效防治DR的途徑。

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(收稿：2017-03-15)

Quantitative analyses of tissue factor and vascular endothelial growth factor levels in aqueous humor and vitreous in patients with diabetic retinopathy

XuChen,MiaoLin,ChenLijuan.

ShanghaiPutuoDistrictPeople’sHospital, 200333;ChenHui.AffiliatedHospitalofNantongMedicalUniversity,Nantong,Jiangsu226000,China

Objective To investigate the correlation between the concentrations of tissue factor (TF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aqueous humor and vitreous and the degree of diabetic retinopathy. Methods 50 patients who

cataract surgery and/or combined vitrectomy in our hospital between Jan 2014 and Dec 2015 were selected. Subjects in this study were divided into 5 groups - group A: healthy control; group B: diabetic patients without retinopathy; group C: diabetic retinopathy; group D: proliferative diabetic retinopathy (PDR); group E, vitrectomy control. Each group had 10 subjects. Samples of aqueous humor in group A, B, C and D and vitreous specimens in group D and E were collected. Double-antibody sandwich ELISA quantitative was used to determine the concentrations of TF and VEGF in aqueous humor and vitreous. Results Levels of TF and VEGF in both aqueous humor and vitreous showed a positive correlation to the degree of retinopathy. In PDR group (group D), both TF and VEGF were significant higher compared to the other three groups (group A, B, C) (P<0.001). Meanwhile, vitreous TF and VEGF levels were significant higher in group D than in group E (P<0.001). Levels of VEGF and TF showed positive correlation significantly in both aqueous humor and vitreous (P<0.01). Conclusions Expression of TF and VEGF may play a key role in the progression of diabetic retinopathy. Therefore, inhibiting or reducing TF and VEGF level in aqueous humor and vitreous may prevent the progression of diabetic retinopathy.

Diabetic Retinopathy; Vascular endothelial growth factor; Tissue factor;Aqueous;Vitreous

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.04.005

200333 上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院(徐晨、苗林、陳麗娟)；226000 南通大學(xué)附屬醫(yī)院(陳輝)

徐晨(Email:xuchen0513@126.com)