曲麗媛，朱媛，李先哲，胡強，王超艷，李夢文，史功，王鑫

臍血間充質干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定技術體系的建立

曲麗媛，朱媛，李先哲，胡強，王超艷，李夢文，史功，王鑫＊

臍帶血；白細胞抗原；免疫表型；標志物

干細胞是一類具有自我更新能力且同時具有分化潛能的細胞，在特定的條件下，它可以分化成多種功能細胞或組織器官，目前已從不同種屬的受精卵、胚胎或成體等分離出多種來源的干細胞［1］。該研究擬建立從臍血中分離培養(yǎng)鑒定細胞株的技術體系，或可為基礎研究中創(chuàng)傷修復提供種子材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料臍帶血來自筆者所在醫(yī)院手術室，獲知情同意，并報院醫(yī)學倫理委員會備案。分離液購自Beyondtime，培養(yǎng)基購自GIBCO BRL，抗體購自BD，引物由Biotech合成。

1.2 實驗儀器流式細胞儀BD FACS；倒置相差顯微鏡Olympus；PCR擴增儀FPROGO2D

1.3 實驗方法

1.3.1 Percoll液分離臍帶血細胞株嚴格無菌環(huán)境，臍血標本以等量的PBS緩沖液混勻，緩慢滴入到等量的淋巴細胞分離液（1.073 kg/L），650 g離心15min。抽取白膜層細胞，以等量的PBS緩沖液洗滌離心，基礎培養(yǎng)液（DMEM/F12，10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺）重懸，接種至100mm培養(yǎng)皿，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞貼壁后，第3天首次半量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3～4 d換液1次。細胞達80%融合后，用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）的胰酶消化，按1∶2～1∶3傳代，續(xù)擴增培養(yǎng)。

1.3.2 形態(tài)學觀察倒置相差顯微鏡下細胞生物學性狀

1.3.3 流式細胞術檢測相關白細胞抗原表達情況收集P9代細胞，制成106個/ml單細胞懸液，每份取100μl，分別加入抗CD3、CD4、CD15、CD34、CD29、CD90的熒光標記的單克隆抗體，室溫孵30min，PBS洗細胞3次，PI染色15min后，上FACS檢測，同時設置空白對照。

1.3.4 RT-PCR檢測細胞株角蛋白8（CK-8）mRNA表達情況PCR反應體系（50μl）：模板2μl、Reaction Buffer（10×）5μl、dNTPs（10 mM）1μl、Primer A 0.5μl、Primer S 0.5μl、Taq polymerase 0.5μl、MiliQ H2O 40.5μl。PCR反應條件：94℃30sec，Anneal Temp 30sec，72℃30sec，共35個循環(huán)后72℃延伸10min。擴增后的產物行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。設計CK8及GAPDH引物序列，見表1。PCR反應檢測細胞株各代（P3代、P9代和P15代）細胞肝特異基因表達情況。

表1 角蛋白8（CK-8）、GAPDH引物序列

2 結果

2.1 生物學性狀觀察原代培養(yǎng)接種1 h后開始貼壁，12 h已大量貼壁并伸展開，形態(tài)均一呈長梭形，24～72 h貼壁細胞明顯增大且分裂增殖，形成集落。3 d后更換培養(yǎng)基，隔日再換液一次去除懸浮細胞，待5 d時細胞已基本完全融合，消化傳代，記為P1，依次類推。于倒置相差顯微鏡下觀察P9代細胞生長情況，細胞呈圓形，折光性好，細胞密度高呈規(guī)則旋渦狀或集束輻射狀，圖1所示。

圖1 細胞株形態(tài)學觀察（P9代，200X）

2.2 檢測細胞株表面白細胞抗原標志流式細胞儀結果顯示，CD3、CD4、CD15、CD34為陰性，據此判斷所建細胞株排除掉為造血譜系細胞、粒細胞/巨噬細胞等的可能；CD29、CD90表達為陽性，提示該細胞可能為間質類干細胞。見圖2。

圖2 細胞株表面白細胞CD抗原標志的檢測

2.3 PCR檢測特異標志物基因表達情況通過PCR反應檢測結果如圖3所示，該細胞株不同代數CK8角蛋白標志物基因表達情況，CK8在P3代細胞中可疑陽性表達，陽性信號弱，隨著代數增加，在第9代、第15代呈陽性表達，提示此細胞株混合有上皮細胞，抑或隨著培養(yǎng)代數的增加細胞株出現分化。

圖3 PCR檢測CK 8基因表達情況

3 討論

臍血是胎兒娩出、臍帶結扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，通常廢棄不用，近年來研究發(fā)現，臍血中含有多種細胞成分［2］，除成體基質細胞外，還含有造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和多能成體祖細胞（multipotent adult progenitor cells，MAPCs）等。間充質干細胞屬混雜細胞群，其表面抗原也具有非專一性，它可表達間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標志，同時不表達造血細胞的表面標志，如CD3、CD4、CD5、CD34、CD45等［3-5］。該實驗采取密度梯度離心與直接貼壁法相結合，先用淋巴細胞分離液對臍帶血進行密度梯度離心，收獲的中間層細胞中含有較多的單個核細胞；再經反復貼壁培養(yǎng)和除去懸浮生長細胞，得到較多貼壁細胞，擴增培養(yǎng)后呈現成纖維細胞樣形態(tài)，具有旺盛的分裂增殖能力，免疫表型表達CD29、CD90，且對角蛋白8基因表達情況進行了檢測，據此可判斷此臍帶血來源細胞株為間充質干細胞，進而可為實驗室中研究創(chuàng)傷再生修復機制提供種子細胞來源。

［1］Kheirandish M，Gavgani SP，Samiee S.The effect of hypoxia preconditioning on the neural and stemness genes expression profiling in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells［J］.Transfus Apher Sci，2017，31（3）：30056.

［2］Fujii S，Miura Y，Iwasa M，et al.Isolation ofmesenchymal stromal/ stem cells from cryopreserved umbilical cord blood cells［J］.J Clin Exp Hematop，2017，18（4）：3960.

［3］Lee JS，Hong JM，Moon GJ，et al.A long-term follow-up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke［J］.Stem Cells，2010，28（6）：1099-1106.

［4］Hou RQ，Wang J，Kong Y，et al.Transfusion of mesenchymal stem cells combined with haploidentical HSCT improves hematopoietic microenvironment［J］.Zhongguo Shiyan Xueyexue Zazhi，2010，18（1）：155-160.

［5］Najar M，Raicevic G，Fayyad-Kazan H，et al.Immune-related antigens，surface molecules and regulatory factors in humanderived mesenchymal stromal cells:the expression and impact of inflammatory priming［J］.Stem Cell Reviews，2012，8（4）：1188-1198.

［2017－02－24收稿，2017－03－22修回］［本文編輯：吳蓉］

醫(yī)學論文中討論的基本要求

1.重點突出，論點明確。首先應確立討論重點和論點，緊緊圍繞重點和論點的某一兩個問題進行，切忌平鋪直敘，面面俱到，更不要借題發(fā)揮，脫離主題。

2.堅持實事求是。在實事求是前提下，要敢于標新立異，在“異”字上深入討論，不要避談與他人結果、結論不同之處，也要正視可能存在的問題；對暫時還無法解釋的現象，或有待解決的問題應該客觀地指出，并提出自己的推理及可能的研究方向，以啟發(fā)讀者思考和關注。對他人的結果或結論不貶低，不輕視；對尚未定論的問題宜謹慎，不武斷。

3.堅持以我為主。如屬獨創(chuàng)性實驗設計或首先采用的實驗方法，應討論其原理、意義及作用；如在他人基礎上改進，應說明改進的利弊，并適當進行分析比較；對所獲結果應客觀地分析與判斷，從而得出自己的結論。引用文獻應準確、恰當，目的是旁證，因此，應提倡以引用結論為主的原則，避免大量引用他人的具體結果等。在不失原意的前提下，盡可能采取“間接引語”的方式，以減少文字，節(jié)省篇幅。

4.避免重復。（1）與引言重復，即討論中重提引言的內容，這可能與引言中過多涉及屬于討論的問題有關。（2）與結果重復，即討論重復敘述一些具體數據、圖表特征等，對此，應強調善于高度概括、精選結果內容的重要性。（3）與他人著述重復，即大段引用原著或原文。（4）與教科書內容重復，即過多引用教科書的現成內容。教科書上的內容一般比較成熟，過多引用可使論文水平降低。

摘自《醫(yī)學論文與書稿編寫技巧》

R329

B

10.14172/j.issn1671-4008.2017.08.025

264002山東煙臺，解放軍107醫(yī)院手術室（曲麗媛），門診部（朱媛），輸血科（李先哲，王超艷，李夢文，史功，王鑫），燒傷科（胡強），中心實驗室（史功，王鑫）

王鑫，Email：wang3j@gmail.com