曲麗媛，朱媛，李先哲，胡強(qiáng)，王超艷，李夢文，史功，王鑫

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定技術(shù)體系的建立

曲麗媛，朱媛，李先哲，胡強(qiáng)，王超艷，李夢文，史功，王鑫＊

臍帶血；白細(xì)胞抗原；免疫表型；標(biāo)志物

干細(xì)胞是一類具有自我更新能力且同時(shí)具有分化潛能的細(xì)胞，在特定的條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞或組織器官，目前已從不同種屬的受精卵、胚胎或成體等分離出多種來源的干細(xì)胞［1］。該研究擬建立從臍血中分離培養(yǎng)鑒定細(xì)胞株的技術(shù)體系，或可為基礎(chǔ)研究中創(chuàng)傷修復(fù)提供種子材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料臍帶血來自筆者所在醫(yī)院手術(shù)室，獲知情同意，并報(bào)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案。分離液購自Beyondtime，培養(yǎng)基購自GIBCO BRL，抗體購自BD，引物由Biotech合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器流式細(xì)胞儀BD FACS；倒置相差顯微鏡Olympus；PCR擴(kuò)增儀FPROGO2D

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Percoll液分離臍帶血細(xì)胞株嚴(yán)格無菌環(huán)境，臍血標(biāo)本以等量的PBS緩沖液混勻，緩慢滴入到等量的淋巴細(xì)胞分離液（1.073 kg/L），650 g離心15min。抽取白膜層細(xì)胞，以等量的PBS緩沖液洗滌離心，基礎(chǔ)培養(yǎng)液（DMEM/F12，10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺）重懸，接種至100mm培養(yǎng)皿，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，第3天首次半量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每3～4 d換液1次。細(xì)胞達(dá)80%融合后，用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）的胰酶消化，按1∶2～1∶3傳代，續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下細(xì)胞生物學(xué)性狀

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測相關(guān)白細(xì)胞抗原表達(dá)情況收集P9代細(xì)胞，制成106個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，每份取100μl，分別加入抗CD3、CD4、CD15、CD34、CD29、CD90的熒光標(biāo)記的單克隆抗體，室溫孵30min，PBS洗細(xì)胞3次，PI染色15min后，上FACS檢測，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。

1.3.4 RT-PCR檢測細(xì)胞株角蛋白8（CK-8）mRNA表達(dá)情況PCR反應(yīng)體系（50μl）：模板2μl、Reaction Buffer（10×）5μl、dNTPs（10 mM）1μl、Primer A 0.5μl、Primer S 0.5μl、Taq polymerase 0.5μl、MiliQ H2O 40.5μl。PCR反應(yīng)條件：94℃30sec，Anneal Temp 30sec，72℃30sec，共35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。設(shè)計(jì)CK8及GAPDH引物序列，見表1。PCR反應(yīng)檢測細(xì)胞株各代（P3代、P9代和P15代）細(xì)胞肝特異基因表達(dá)情況。

表1 角蛋白8（CK-8）、GAPDH引物序列

2 結(jié)果

2.1 生物學(xué)性狀觀察原代培養(yǎng)接種1 h后開始貼壁，12 h已大量貼壁并伸展開，形態(tài)均一呈長梭形，24～72 h貼壁細(xì)胞明顯增大且分裂增殖，形成集落。3 d后更換培養(yǎng)基，隔日再換液一次去除懸浮細(xì)胞，待5 d時(shí)細(xì)胞已基本完全融合，消化傳代，記為P1，依次類推。于倒置相差顯微鏡下觀察P9代細(xì)胞生長情況，細(xì)胞呈圓形，折光性好，細(xì)胞密度高呈規(guī)則旋渦狀或集束輻射狀，圖1所示。

圖1 細(xì)胞株形態(tài)學(xué)觀察（P9代，200X）

2.2 檢測細(xì)胞株表面白細(xì)胞抗原標(biāo)志流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，CD3、CD4、CD15、CD34為陰性，據(jù)此判斷所建細(xì)胞株排除掉為造血譜系細(xì)胞、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞等的可能；CD29、CD90表達(dá)為陽性，提示該細(xì)胞可能為間質(zhì)類干細(xì)胞。見圖2。

圖2 細(xì)胞株表面白細(xì)胞CD抗原標(biāo)志的檢測

2.3 PCR檢測特異標(biāo)志物基因表達(dá)情況通過PCR反應(yīng)檢測結(jié)果如圖3所示，該細(xì)胞株不同代數(shù)CK8角蛋白標(biāo)志物基因表達(dá)情況，CK8在P3代細(xì)胞中可疑陽性表達(dá)，陽性信號(hào)弱，隨著代數(shù)增加，在第9代、第15代呈陽性表達(dá)，提示此細(xì)胞株混合有上皮細(xì)胞，抑或隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加細(xì)胞株出現(xiàn)分化。

圖3 PCR檢測CK 8基因表達(dá)情況

3 討論

臍血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，通常廢棄不用，近年來研究發(fā)現(xiàn)，臍血中含有多種細(xì)胞成分［2］，除成體基質(zhì)細(xì)胞外，還含有造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和多能成體祖細(xì)胞（multipotent adult progenitor cells，MAPCs）等。間充質(zhì)干細(xì)胞屬混雜細(xì)胞群，其表面抗原也具有非專一性，它可表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志，同時(shí)不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志，如CD3、CD4、CD5、CD34、CD45等［3-5］。該實(shí)驗(yàn)采取密度梯度離心與直接貼壁法相結(jié)合，先用淋巴細(xì)胞分離液對(duì)臍帶血進(jìn)行密度梯度離心，收獲的中間層細(xì)胞中含有較多的單個(gè)核細(xì)胞；再經(jīng)反復(fù)貼壁培養(yǎng)和除去懸浮生長細(xì)胞，得到較多貼壁細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)后呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，具有旺盛的分裂增殖能力，免疫表型表達(dá)CD29、CD90，且對(duì)角蛋白8基因表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，據(jù)此可判斷此臍帶血來源細(xì)胞株為間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)而可為實(shí)驗(yàn)室中研究創(chuàng)傷再生修復(fù)機(jī)制提供種子細(xì)胞來源。

［1］Kheirandish M，Gavgani SP，Samiee S.The effect of hypoxia preconditioning on the neural and stemness genes expression profiling in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells［J］.Transfus Apher Sci，2017，31（3）：30056.

［2］Fujii S，Miura Y，Iwasa M，et al.Isolation ofmesenchymal stromal/ stem cells from cryopreserved umbilical cord blood cells［J］.J Clin Exp Hematop，2017，18（4）：3960.

［3］Lee JS，Hong JM，Moon GJ，et al.A long-term follow-up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke［J］.Stem Cells，2010，28（6）：1099-1106.

［4］Hou RQ，Wang J，Kong Y，et al.Transfusion of mesenchymal stem cells combined with haploidentical HSCT improves hematopoietic microenvironment［J］.Zhongguo Shiyan Xueyexue Zazhi，2010，18（1）：155-160.

［5］Najar M，Raicevic G，F(xiàn)ayyad-Kazan H，et al.Immune-related antigens，surface molecules and regulatory factors in humanderived mesenchymal stromal cells:the expression and impact of inflammatory priming［J］.Stem Cell Reviews，2012，8（4）：1188-1198.

［2017－02－24收稿，2017－03－22修回］［本文編輯：吳蓉］

醫(yī)學(xué)論文中討論的基本要求

1.重點(diǎn)突出，論點(diǎn)明確。首先應(yīng)確立討論重點(diǎn)和論點(diǎn)，緊緊圍繞重點(diǎn)和論點(diǎn)的某一兩個(gè)問題進(jìn)行，切忌平鋪直敘，面面俱到，更不要借題發(fā)揮，脫離主題。

2.堅(jiān)持實(shí)事求是。在實(shí)事求是前提下，要敢于標(biāo)新立異，在“異”字上深入討論，不要避談與他人結(jié)果、結(jié)論不同之處，也要正視可能存在的問題；對(duì)暫時(shí)還無法解釋的現(xiàn)象，或有待解決的問題應(yīng)該客觀地指出，并提出自己的推理及可能的研究方向，以啟發(fā)讀者思考和關(guān)注。對(duì)他人的結(jié)果或結(jié)論不貶低，不輕視；對(duì)尚未定論的問題宜謹(jǐn)慎，不武斷。

3.堅(jiān)持以我為主。如屬獨(dú)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或首先采用的實(shí)驗(yàn)方法，應(yīng)討論其原理、意義及作用；如在他人基礎(chǔ)上改進(jìn)，應(yīng)說明改進(jìn)的利弊，并適當(dāng)進(jìn)行分析比較；對(duì)所獲結(jié)果應(yīng)客觀地分析與判斷，從而得出自己的結(jié)論。引用文獻(xiàn)應(yīng)準(zhǔn)確、恰當(dāng)，目的是旁證，因此，應(yīng)提倡以引用結(jié)論為主的原則，避免大量引用他人的具體結(jié)果等。在不失原意的前提下，盡可能采取“間接引語”的方式，以減少文字，節(jié)省篇幅。

4.避免重復(fù)。（1）與引言重復(fù)，即討論中重提引言的內(nèi)容，這可能與引言中過多涉及屬于討論的問題有關(guān)。（2）與結(jié)果重復(fù)，即討論重復(fù)敘述一些具體數(shù)據(jù)、圖表特征等，對(duì)此，應(yīng)強(qiáng)調(diào)善于高度概括、精選結(jié)果內(nèi)容的重要性。（3）與他人著述重復(fù)，即大段引用原著或原文。（4）與教科書內(nèi)容重復(fù)，即過多引用教科書的現(xiàn)成內(nèi)容。教科書上的內(nèi)容一般比較成熟，過多引用可使論文水平降低。

摘自《醫(yī)學(xué)論文與書稿編寫技巧》

R329

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10.14172/j.issn1671-4008.2017.08.025

264002山東煙臺(tái)，解放軍107醫(yī)院手術(shù)室（曲麗媛），門診部（朱媛），輸血科（李先哲，王超艷，李夢文，史功，王鑫），燒傷科（胡強(qiáng)），中心實(shí)驗(yàn)室（史功，王鑫）

王鑫，Email：wang3j@gmail.com