張妙賢，李珂，趙光，李寶輝，巴武龍，盧圣勛，鄒陽(yáng)

單純室間隔缺損與房間隔缺損患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

張妙賢，李珂＊，趙光，李寶輝，巴武龍，盧圣勛，鄒陽(yáng)

目的應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）技術(shù)對(duì)單純性室間隔缺損（ventrieular septal defect，VSD）、房間隔缺損（atrial septal defect，ASD）患者術(shù)前、術(shù)后及正常人血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析，得到高敏感性和特異性的血清蛋白，建立診斷模型指紋圖譜。方法采用MALDI－TOF－MS技術(shù)分別檢測(cè)27例單純VSD、ASD患者與20名正常人血清蛋白相對(duì)含量，運(yùn)用Flex Analysis和Bio Tools軟件對(duì)兩組血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析；篩選出差異蛋白，再通過(guò)分析軟件對(duì)其進(jìn)行交叉驗(yàn)證，得到具有診斷意義的特異性蛋白標(biāo)志物。結(jié)果檢測(cè)到蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（M/Z）在600～10500Da范圍內(nèi)，單純VSD、ASD組與正常人組有差異的蛋白質(zhì)峰為15個(gè)（P＜0．05）。生物標(biāo)記物可以將單純VSD、ASD組與正常人準(zhǔn)確地分組，其敏感性為91．5%，特異性為97．2%。結(jié)論MALDI－TOF－MS技術(shù)對(duì)單純VSD、ASD組術(shù)前、術(shù)后及正常人組血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析，可以篩選出單純VSD、ASD患者的特異性血清標(biāo)志物。

單純性室間隔缺損；房間隔缺損；基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；血清蛋白

室間隔缺損（ventrieular septal defect，VSD）、房間隔缺損（atrial septal defect，ASD）是臨床常見(jiàn)的先天性心臟病，Harris等［1］研究發(fā)現(xiàn)，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）能夠調(diào)控心臟膠原蛋白的形成以及膠原蛋白與成纖維細(xì)胞分子間的相互作用，說(shuō)明先天性心臟病在蛋白質(zhì)水平方面應(yīng)該就已經(jīng)發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)可以從細(xì)胞整體水平上檢測(cè)到這種變化，這些發(fā)生的蛋白質(zhì)變化都有可能成為臨床監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。

基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization－time of flightmass spectrometry，MALDI－TOF－MS）技術(shù)，主要是通過(guò)快速分析細(xì)胞以及組織中蛋白荷比的變化來(lái)了解細(xì)胞所產(chǎn)生的生物學(xué)變化［2］，直接獲取某種疾病的特征生物學(xué)標(biāo)記。質(zhì)譜分析技術(shù)近年已逐漸應(yīng)用于胃癌、小細(xì)胞肝癌、乳腺癌、大腸癌及卵巢癌等惡性腫瘤早期診斷的探索性研究［3－8］，該研究旨在應(yīng)用質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)單純VSD、ASD患者與正常人血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析，從中篩選差異性多肽和蛋白，建立診斷模型指紋圖譜，對(duì)單純VSD、ASD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探索。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組先心病組VSD和ASD血清樣本27例取自筆者所在醫(yī)院2015年4月—2015年10月住院的單純性VSD和ASD患者，經(jīng)超聲心動(dòng)圖診斷并經(jīng)心臟手術(shù)確診，年齡0.5～40歲，治療前、治療后排除其他先天畸形，無(wú)發(fā)熱、炎癥等可能影響檢測(cè)結(jié)果的情況。健康對(duì)照組20名血清樣本取自同期該醫(yī)院體檢正常的健康者。兩組間性別、種族及月齡按1∶1匹配。出生地均為河南省。先心病組27例，分術(shù)前組19例與術(shù)后組8例（預(yù)報(bào)集數(shù)與校正集數(shù)，分別為13∶6與5∶3）；正常組20名（預(yù)報(bào)集數(shù)與校正集數(shù)為13和7）。

1.2 儀器試劑與方法

1.2.1 儀器試劑Eppendorf公司的磁珠分離器、微量加樣槍、高速臺(tái)式離心機(jī)、SCOUT-MTP樣品靶，Bruck公司的AUTOFLEX TOF/TOF質(zhì)譜儀及Reveo公司的超低溫冰箱、通風(fēng)櫥等。試劑采用銅整合磁珠懸浮液、銅整合磁珠清洗緩沖液（WS）、銅整合磁珠結(jié)合緩沖液（BS）、銅整合磁珠清洗脫緩沖液（ES）、基質(zhì)（3mg/mlCHCA，50%ACN，2%TFA）等。

1.2.2 樣品收集患者入院次日或手術(shù)次日清晨采集空腹靜脈血3m l，普通干燥管靜置于4℃冰箱內(nèi)2 h，2000 r/min離心10～20min，取上清按100μl管分裝標(biāo)記，置于-70℃超低溫冰箱保存。血清樣品、樣品靶進(jìn)行結(jié)合前生化處理后，血清蛋白與標(biāo)準(zhǔn)靶進(jìn)行結(jié)合：樣品10μl置于1.5ml離心管中，混勻磁珠懸浮液，取5μl磁珠加入樣品管，再加入50μlBS，將樣品管放入磁珠分離器，在前后相鄰兩孔間反復(fù)移動(dòng)樣品管10次混勻，分離后用加樣槍吸去樣品管中的溶液，向樣品管中加入20μl BS使磁珠重新懸浮、分離，再向樣品管中加入100μl WS，在磁珠分離器內(nèi)混勻，向樣品管中加入10μl ES混勻，磁珠與洗脫液分離，用加樣槍將洗脫下來(lái)的多肽樣品溶液小心移入干凈的0.5ml樣品管，點(diǎn)1μl洗脫樣品及1μl基質(zhì)于樣品靶。提取出47份血清中蛋白成分。

1.2.3 質(zhì)譜檢驗(yàn)及樣品統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將制備好的SCOUT-MTP樣品靶通過(guò)AUTOFLEX TOF/TOF質(zhì)譜儀檢測(cè)口放入并固定，啟動(dòng)脈沖激光，擊打樣品靶點(diǎn)，通過(guò)flex Control的setup設(shè)置儀器參數(shù)，當(dāng)激光開(kāi)始脈沖時(shí)，數(shù)字轉(zhuǎn)換器記錄由檢測(cè)器檢測(cè)到的模擬信號(hào)，并將它們轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。

采集系統(tǒng)運(yùn)用Flex Analysis軟件，設(shè)定激光能量、譜圖評(píng)估參數(shù)、譜圖疊加次數(shù)，靶的移動(dòng)方式和范圍等參數(shù)。應(yīng)用Bio Tools軟件對(duì)47個(gè)待測(cè)樣品分析，分析模式：線(xiàn)性正離子模式，質(zhì)量數(shù)范圍：600～10500Da?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)分析（基于MATLAB 7.0）。

2 結(jié)果

2.1 兩組差異蛋白表達(dá)情況M/Z值為600～10500 Da范圍內(nèi)篩選出15個(gè)蛋白在單純VSD、ASD組與正常人表達(dá)有差異，均方根誤差為0.59，且M/Z值600、603、608、611、621、6405 Da的蛋白質(zhì)在單純VSD、ASD組中高表達(dá)，在正常人組中低表達(dá)；M/Z值4103、4416、4888、4917、5907、5922、5926、7475、7487 Da的蛋白質(zhì)在單純VSD、ASD組中低表達(dá)，在正常人組中高表達(dá)（表1、圖1）。

表1 單純VSD和ASD與正常人分組差異蛋白表達(dá)情況（x±s）

圖1 連續(xù)投影法顯示單純VSD、ASD與正常人分組差異蛋白表達(dá)情況

2.2 結(jié)果驗(yàn)證運(yùn)用最小二乘-支持向量機(jī)（least square-support vector machine，LS-SVM）；徑向基-神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（radial-basis function neural network，RBF-NN）的非線(xiàn)性驗(yàn)證及線(xiàn)性判別分析（linear discriminate analysis，LDA），進(jìn)行雙盲驗(yàn)證，得到單純VSD、ASD與正常人分組差異蛋白表達(dá)的敏感性與特異性分析（表2）。

表2 單純VSD和ASD與正常人分組差異蛋白表達(dá)情況分析

3 討論

該研究收集了與心臟外科相關(guān)疾病的術(shù)前、術(shù)后患者以及正常人的外周血樣本；樣本經(jīng)WCX磁珠處理后，得到血清中蛋白組分。應(yīng)用MALDI TOF MS線(xiàn)性正離子模式對(duì)樣本檢測(cè)，并獲取了600～10500m/z的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（蛋白組）。為了使獲得的數(shù)據(jù)充分有效，應(yīng)用平滑和基線(xiàn)消除的方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理；之后應(yīng)用連續(xù)投影算法尋求與疾病診斷、預(yù)后相關(guān)的蛋白/多肽，這些蛋白/多肽構(gòu)成了該疾病的指紋圖譜。為了驗(yàn)證該指紋圖譜的準(zhǔn)確度，本研究應(yīng)用主成分分析以及受試者工作曲線(xiàn)分析；為了驗(yàn)證該指紋圖譜的有效性，本研究應(yīng)用有監(jiān)督模式識(shí)別方法構(gòu)建校正預(yù)報(bào)模型（LSSVM，LDA和RBFNN）。篩選出的15個(gè)變量，交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示，以M/Z值為600、603、608、611、621、6405Da的蛋白質(zhì)，在單純VSD、ASD組中高表達(dá)，在正常人組中低表達(dá)；以M/Z值4103、4416、4888、4917、5907、5922、5926、7475、7487 Da的蛋白質(zhì)，在單純VSD、ASD組中低表達(dá)，在正常人組中高表達(dá)；以上蛋白質(zhì)在單純VSD、ASD組術(shù)前、術(shù)后的檢測(cè)中差異不顯著。結(jié)果表明，單純VSD、ASD患者與正常人在血清蛋白質(zhì)譜中存在差異性多肽和蛋白；且利用MALDI-TO-MS技術(shù)和Flex Analysis和Bio Tools軟件可較準(zhǔn)確地將單純性VSD、ASD組與正常人分開(kāi)，其特異性為97.2%，敏感性為91.5%。

［1］Harris BS，Zhang Y，Card L，et al.SPA R C regulates collagen interaction with cardiac fibroblast cell surfaces［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，301（3）：H841-847.

［2］Vestal ML.Modern MALDI time-of-flightmass spectrometry［J］. JMass Spectrom，2009，44（3）：303-317.

［3］Sauter ER，Davis W，Qin W，et al Identiication of a beta-caseinlike peptide in breast nipple aspirate luid that is associated with breast cancer［J］.Biomark Med，2009，3（5）：577-588.

［4］Helgason HH，Engwegen JY，Zapatka M，et al.Identiication of serum proteins as prognostic and predictive markers of colorectal cancer using surface enhanced laser desorption ionization-time of light mass spectrometry［J］.Oncol Rep，2010，24（1）：57-64.

［5］李珂，何偉華，趙光，等.MALDI-TOF-MS技術(shù)篩查原發(fā)性小細(xì)胞肝癌血清特異蛋白［J］.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2012，29（12）：1060-1064.

［6］Lu HB，Zhou JH，Ma YY，et al.Five serum proteins identified using MALDI-TO-MS as potential biomarkers of gastric cancer［J］.Jpn J Clin Oncol，2010，40（4）：336-342.

［7］Wang Y，Yu JJ，Zhu T，et al.Analysis of diferentially expressd protein from primary and recurrent ovarian cancer serum［J］. Asian Pac J Trop Med，2012，5（7）：573-576.

［8］Wu S，Xu K，Chen G，et al.Identiication of serum biomarkers for ovarian cancer using MALDI-TOF-MS combined with magnetic beads［J］.Int J Clin Oncol，2012，17（2）：89-95.

［2017－02－15收稿，2017－03－19修回］

［本文編輯：王茜］

Proteom ics analysis on serum proteins of simple VSD or ASD patients

ZHANG Miao－xian①，LI Ke，ZHAO Guang，et al．
①Dept．of Special Examination，the No．150 Hospital of People Liberation Army，Luoyang，Henan 471031，China

Obiective By using the technique of matrix assisted laser desorption/ionization－time of flightmass spectrometry（MALDI－TOF－MS）to analyse the serum protein spectrum and to get high sensitivity and specificity protein marker in simple ventricular septal defect（VSD），atrial septal defect（ASD）patients（preoperative/after－operation）and normal persons，then to establish serum markers pattern for the diagnosis of VSD/ASD．M ethods The technique of MALDI－TOF－MS was used to detect relative content of serum in 27 cases of VSD/ASD and 20 normal persons，and the Flex Analysis and BioTools software was used to analyse protein spectrum in two groups to find specific proteomic，then through the analysis software for cross－validation to get a diagnosis from specific proteins．Results There were 15 protein's peaks having significant discrepancy in the 600－10500Da（P＜0．05）．The sensitivity and specificity was 91．5%and 97．2%respectively．Conclusion By using MALDI－TOF－MS to analyze serum protein spectrum in VSD/ASD group（preoperative/after－operation）and normal group could get the specific serum protein markers for diagnosis of VSD/ASD．

Ventricular septal defect；Atrial septal defect；MALDI－TOF－MS；Serum protein

Q26：R541．1

A

10．14172/j．issn1671－4008．2017．08．009

471031河南洛陽(yáng)，解放軍150醫(yī)院特檢科（張妙賢，李珂），中心實(shí)驗(yàn)室（趙光，李寶輝，巴武龍），心血管科（盧圣勛，鄒陽(yáng)）

李珂，Email：likehesiyuan＠163．com