劉建霞++王思++王潤(rùn)梅++溫日宇

摘 要：本文旨在探究一種最優(yōu)的黃酮提取工藝條件，在此種條件下提取不同種類紅小豆中的黃酮，測(cè)定其含量，并對(duì)不同種類紅小豆中黃酮含量的差異進(jìn)行比對(duì)，選出含量最高的品系。從實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)和結(jié)果分析顯示，采用超聲波輔助法提取紅小豆中的黃酮，最優(yōu)的提取條件是：超聲時(shí)間為50min，超聲溫度為33℃，乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1：50。不同品系紅小豆中黃酮的含量有差異。河北承德紅小豆黃酮含量最高；江西撫順、河北玉田等紅小豆黃酮含量次之，廣西巴馬紅小豆黃酮含量最低。

關(guān)鍵詞：紅小豆；黃酮；提取；超聲波輔助法

中圖分類號(hào)：S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170732001

紅小豆（Phaseolus angularis ），屬于豆科一年生草本植物，營(yíng)養(yǎng)組成中淀粉含量比較高，由此又被稱為“飯豆”。同時(shí)也被李時(shí)珍稱為“心之谷”。由于其藥用價(jià)值顯著，是人們生活所必須的多功能、高營(yíng)養(yǎng)的雜糧，所以在我國(guó)各地種植廣泛。它的特質(zhì)甘平，能夠補(bǔ)血、利小便、消脹滿、通乳、解毒；同時(shí)對(duì)風(fēng)濕、黃疸尿赤、腳氣浮腫都有很好的治療作用。隨著研究的發(fā)現(xiàn)，逐漸地被廣泛應(yīng)用在醫(yī)療事業(yè)中[1，2]。

黃酮類化合物是一類生物活性物質(zhì)，具有特殊的保健作用和療效，在植物、果醬中含量豐富[3]。比如黃酮具有抗氧化功能，能夠很好的消除人體內(nèi)的氧自由基，可以有效的阻止細(xì)胞的衰老，預(yù)防癌癥；也可以改善血液循環(huán)、從而降低心腦血管疾病的發(fā)病率、亦能降低膽固醇。同時(shí)黃酮對(duì)糖尿病引發(fā)的視網(wǎng)膜病有很好的療效。因此，研究紅小豆中黃酮含量的高低對(duì)評(píng)價(jià)紅小豆藥效價(jià)值、藥理作用、藥理活性都有極其重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

目前，許多植物黃酮的研究已經(jīng)相對(duì)成熟，如銀杏[5]花生[6] 等黃酮的研究。但對(duì)紅小豆黃酮含量的報(bào)道研究甚少。在提取黃酮領(lǐng)域，常用的方法主要有超聲波輔助提取法、乙醇浸提法、微波加熱提取法[7]等。超聲波輔助提取法簡(jiǎn)單，易操作一些，條件相對(duì)也容易控制[8]，本文旨在探究一種最優(yōu)的紅小豆黃酮提取工藝條件，在此種條件下提取不同種類紅小豆中的黃酮，測(cè)定其含量，并對(duì)不同種類紅小豆中黃酮含量的差異進(jìn)行比較，選出含量最高的紅小豆。通過測(cè)定不同種紅小豆中黃酮含量，為紅小豆藥用價(jià)值的評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

紅小豆（廣西巴馬、江蘇南通、江西撫順、河北玉田、河北承德、山東臨沂、山西忻州等）一共7個(gè)品系，均來自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[9]，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度與吸光度值見表1，按畫坐標(biāo)方式，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，蘆丁的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.2513x+0.1615，R2=0.9914。

1.2.2 制備紅小豆粉

將紅小豆種子保存于陰涼、干燥處，挑選出大小均等、顆粒飽滿的種子。用新型密封式搖擺高速粉碎機(jī)將7種紅小豆種子粉碎。將得到的粉末用紙包好，貼上標(biāo)簽，以區(qū)分不同品系。

1.2.3 提取與測(cè)定紅小豆中黃酮的含量

將用高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)研磨好的紅小豆粉分別放在7個(gè)洗凈的燒杯中，在60℃烘箱中烘干3h到恒重。準(zhǔn)確稱量每種紅小豆粉2.5mg放到相應(yīng)燒杯，按固液比1：40配比。采用超聲輔助法進(jìn)行黃酮的提取，實(shí)驗(yàn)過程溫度不變，恒為33℃，超聲功率為100W，超聲震蕩1.5h以后，冷卻至室溫。用紫外可見分光光度計(jì)在300 nm下測(cè)量黃酮的吸光度值。數(shù)據(jù)表2（每個(gè)紅小豆品系3組重復(fù)）。

1.2.4 紅小豆黃酮含量的計(jì)算

公式如下：

R=ρ×10×40÷（m×1000）

R ─紅小豆種子中黃酮含量%；

ρ─由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的黃酮含量mg· mL-1；

m ─紅小豆種子的質(zhì)量g。

最后算得7種紅小豆（3組重復(fù)）黃酮含量如下所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)

由上圖圖像波動(dòng)情況可以看出，乙醇濃度對(duì)紅小豆黃酮吸光度值的影響呈波峰狀，且在70%時(shí)為最高，小于波峰值時(shí)呈增大趨勢(shì)，大于波峰值時(shí)呈下降勢(shì)。乙醇濃度不同，說明被溶解的紅小豆中的黃酮的量多少有差別，當(dāng)達(dá)到最高量后下降，可能是濃度過高對(duì)黃酮物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)有影響[10，11]，使其被破壞。

2.1.2 最佳超聲時(shí)間

由上圖可知，圖像有峰值，當(dāng)它的時(shí)間超過1.5h后，圖像開始呈下降趨勢(shì)，可能因?yàn)闀r(shí)間延長(zhǎng)，黃酮物質(zhì)會(huì)不穩(wěn)定，隨后發(fā)生分解或可能轉(zhuǎn)化為其它的物質(zhì)，所以適宜提取黃酮的時(shí)間為1.5h。

2.1.3 最佳料液比

由圖可以看出，圖像變化幅度較時(shí)間的影響稍大一些，也呈山峰狀態(tài)，有峰值。當(dāng)超過1：50時(shí)，呈下降的趨勢(shì)，料液比的多少，體現(xiàn)的是其與黃酮的接觸面積，以及溶解黃酮的多少，當(dāng)達(dá)到最高，呈平穩(wěn)趨勢(shì)，說明黃酮已經(jīng)被全部溶解[12]。故不再增加。

2.1.4 最佳的超聲功率

超聲功率的影響，對(duì)紅小豆黃酮的吸光度值影響小，圖像幾乎呈平穩(wěn)狀態(tài)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

正交時(shí)，需要注意的是，在正交試驗(yàn)中各因素的水平數(shù)減1再加上1，便能得出最少試驗(yàn)次數(shù)，和處理組合數(shù)。本實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn)次數(shù)為9次。

影響紅小豆黃酮提取率的因素有4個(gè)：乙醇體積分?jǐn)?shù)，超聲時(shí)間，料液比，超聲功率。綜合顯示得到，它們按影響大小來看，對(duì)黃酮的提取率影響最大的是料液比C，接下來是乙醇體積分?jǐn)?shù)A，然后是超聲時(shí)間B，而第四超聲功率D對(duì)實(shí)驗(yàn)影響幾乎沒有。所以綜合考慮各因素的交互作用選擇最佳優(yōu)化條件為A2B1C2D3，即體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，超聲震蕩時(shí)間為50min，料液比1：50（g：mL）。以上述優(yōu)化選取的工藝條件按上述步驟做驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示總黃酮含量為0.297mg/g與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.3 7個(gè)品系紅小豆種子中黃酮含量的比對(duì)

研究已經(jīng)表明，飲食中豐富的黃酮攝入，可以降低乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，紅小豆中黃酮含量是影響紅小豆品質(zhì)的一個(gè)重要因素，實(shí)驗(yàn)可以得出河北承德地區(qū)的紅小豆黃酮含量比較高[14，15]。

3 結(jié)論與討論

單因素實(shí)驗(yàn)的作用主要為正交實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)的最優(yōu)條件的分析提供相關(guān)理論依據(jù)，利用超聲波清洗器來對(duì)紅小豆黃酮的提取實(shí)驗(yàn)，取山西忻州玉米研究所廣西巴馬紅小豆，將它作為要用的材料，從料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。閱讀大量資料和參考了相關(guān)文獻(xiàn)后[4-8]，確定進(jìn)行紅小豆黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)的基本因素范圍，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～90%、超聲時(shí)間為0.5 h～2.5 h、料液比為1：30～1：70、超聲功率為60～100 W[10-11] 。

在原有文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)黃酮提取方案的基礎(chǔ)之上來進(jìn)行工藝改進(jìn)不僅能夠使紅小豆種子中的黃酮得到很好的應(yīng)用，更能夠縮短提取工藝流程節(jié)省投資，超聲波提取法操作簡(jiǎn)便，能夠通過優(yōu)化提取工藝條件而提高提取率，測(cè)定不同種紅小豆中黃酮的含量并選出含量最高的品種是本實(shí)驗(yàn)的目的，本實(shí)驗(yàn)很好的解決了這一問題，并能發(fā)現(xiàn)紅小豆中黃酮含量相對(duì)之前參考文獻(xiàn)研究的其它物種的黃酮得率更低一些，也為紅小豆的進(jìn)一步研究方向的確定，提供了一定的理論依據(jù)。

經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)、Spass軟件分析以及正交驗(yàn)證性試驗(yàn)，根據(jù)上述結(jié)果，得出最優(yōu)并且可行的紅小豆黃酮提取條件是：在溫度為33℃時(shí)，超聲時(shí)間50min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1：50。不同品系即不同地區(qū)紅小豆的含量顯然是有差異的。河北承德品種黃酮含量最高；江西撫順、河北玉田等品種黃酮含量次之，廣西巴馬品種黃酮含量最低。黃酮類物質(zhì)是紅小豆的主要功能性成分，因此在紅小豆的利用上應(yīng)考慮不同紅小豆黃酮含量的差異。應(yīng)充分利用黃酮含量最高的河北承德紅小豆，使其產(chǎn)生更高的經(jīng)濟(jì)效益。

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作者簡(jiǎn)介：劉建霞（1977-），女，山西山陰人，講師，碩士，主要從事植物種質(zhì)資源開發(fā)與利用。