張?jiān)?黃敏菊 袁秦 李繼彥 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局廣州醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （廣東 廣州 510663）

紫外分光光度法測(cè)定肝素含量的研究

張?jiān)?黃敏菊 袁秦 李繼彥 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局廣州醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （廣東 廣州 510663）

亞甲藍(lán)與肝素發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，在664nm處出現(xiàn)特征峰，肝素含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，用紫外分光光度法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算肝素鈉的含量。并且測(cè)得的肝素含量具有良好的重復(fù)性，是快捷簡(jiǎn)便的定量分析方法。

肝素 亞甲藍(lán) 分光光度法 采血管

1.引言

肝素是一種含有硫酸基團(tuán)的粘多糖[1]，帶有強(qiáng)大的負(fù)電荷，具有加強(qiáng)抗凝血酶III滅活絲氨酸蛋白酶的作用，從而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多種抗凝作用。肝素一般情況下對(duì)相關(guān)指標(biāo)都不會(huì)有干擾，同時(shí)抗凝比例較大（抗凝劑：全血=1:30），對(duì)血液基本沒(méi)有稀釋影響，所以肝素及其相關(guān)產(chǎn)品廣泛用于抗凝藥物，肝素抗凝是最常用的抗凝劑。近年來(lái)有研究證明肝素鈉還有降血脂的作用，肝素鈉在醫(yī)療器械產(chǎn)品中的應(yīng)用非常廣泛且還有廣闊的發(fā)展空間。

肝素管一般用于生化及血流變的檢測(cè)，是電解質(zhì)檢測(cè)的最佳選擇。常見(jiàn)的肝素抗凝管主要是肝素鈉和肝素鋰，也有少數(shù)用肝素銨，但檢驗(yàn)血標(biāo)本中的鈉離子時(shí)，不能使用肝素鈉，以免影響檢測(cè)結(jié)果。也不能用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)，因肝素會(huì)引起白細(xì)胞聚集。采血管的注冊(cè)檢驗(yàn)依據(jù)是YY0314-2007《一次性使用人體靜脈血樣采集容器》，在行標(biāo)中對(duì)肝素管中肝素含量有具體明確的規(guī)定，所以對(duì)肝素含量的檢測(cè)尤為重要。但在行標(biāo)中沒(méi)有對(duì)肝素檢測(cè)方法作具體的規(guī)定，企業(yè)可以自行制定檢驗(yàn)方法，通常從結(jié)果的準(zhǔn)確性、檢驗(yàn)條件和可操作性等方面進(jìn)行考量。

目前，肝素含量的測(cè)定方法有分光光度法[2-3]、熒光法、共振瑞麗散射法、高效毛細(xì)管電泳法。熒光法對(duì)實(shí)驗(yàn)要求較高，操作時(shí)要盡量避光，且操作時(shí)間盡量短，實(shí)驗(yàn)成本較高；共振瑞麗散射法檢測(cè)限低，適用于痕量肝素鈉的檢測(cè)；高效毛細(xì)管電泳法只能用于檢測(cè)臨床肝素鈉在血液中的含量，且由于不同生物個(gè)體的影響，實(shí)驗(yàn)收到限制；分光光度法由于操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確有效，是最常用的檢測(cè)方法。由于大部分企業(yè)是使用紫外分光光度法檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)采用紫外分光光度法測(cè)定肝素鋰、肝素鈉的含量進(jìn)行研究，對(duì)兩者的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，提供切實(shí)可行的操作方案，提高實(shí)際檢測(cè)工作的效率。

圖1. 肝素鈉結(jié)構(gòu)式

圖2. 亞甲藍(lán)結(jié)構(gòu)式

肝素鈉（Heparin Sodium），是由豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬粘多糖類(lèi)物質(zhì)。亞甲藍(lán)（Methylene blue）化學(xué)式：C16H18N3ClS，又稱(chēng)亞甲基藍(lán)、次甲基藍(lán)、次甲藍(lán)、美藍(lán)、品藍(lán)，是一種芳香雜環(huán)化合物。水溶液呈藍(lán)色，常被用作化學(xué)指示劑、染料、生物染色劑和藥物使用。

2.實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器及試劑

紫外吸光度儀（島津公司）、電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）、超純水儀（Milli-Q公司）、亞甲藍(lán)（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、肝素鋰標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱(chēng)取肝素鈉/肝素鋰標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水溶解制成每1ml約含1.25IU的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液0ml、1.0ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0ml分別于25ml容量瓶中，各加入1.0ml亞甲藍(lán)溶液（0.1g/L），加水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0.05 IU/ml、0.10 IU/ml、0.15 IU/ml、0.20 IU/ml、0.25IU/ml），室溫放置1小時(shí)，待測(cè)。

圖3. 肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4. 肝素鋰標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 試樣溶液制備

精密稱(chēng)取一定量肝素鈉加水溶解，移至25ml容量瓶中，加入1.0ml亞甲藍(lán)溶液（0.1g/L），加水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣溶液。得到0.16 IU/ml、0.24 IU/ml三種濃度試樣溶液，室溫放置1小時(shí)，待測(cè)。

2.2.3 測(cè)定方法

以水作為參比，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液在664nm波長(zhǎng)處的吸光度。全部溶液應(yīng)于1小時(shí)之內(nèi)測(cè)完。

表1. 肝素鈉試樣溶液測(cè)定結(jié)果測(cè)得濃度(IU/ml) 平均值(IU/ml) 標(biāo)準(zhǔn)偏差1# 2# 3# 4# 5# 6# 0.08 0.0790 0.0800 0.0795 0.0790 0.0795 0.0795 0.0794 0.000376 0.16 0.1595 0.1605 0.1595 0.1600 0.1605 0.1605 0.1600 0.000492 0.24 0.2410 0.2405 0.2400 0.2405 0.2405 0.2410 0.2406 0.000376試樣溶液濃度(IU/ml)

表2. 由肝素鋰標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的肝素鈉試樣溶液結(jié)果測(cè)定濃度(IU/ml) 平均值(IU/ml) 標(biāo)準(zhǔn)偏差1# 2# 3# 4# 5# 6# 0.08 0.0790 0.0795 0.0800 0.0790 0.0795 0.0795 0.0794 0.000376 0.16 0.1595 0.1605 0.1595 0.1605 0.1600 0.1600 0.1600 0.000447 0.24 0.2410 0.2405 0.2400 0.2405 0.2405 0.2410 0.2406 0.000376試樣溶液濃度(IU/ml)

圖5. 不同濃度肝素與亞甲藍(lán)反應(yīng)的紫外吸收結(jié)果

2.2.4 結(jié)果計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)吸光度進(jìn)行線性回歸，求出回歸方程，再根據(jù)回歸方程計(jì)算出試樣溶液中肝素鈉/肝素鋰的含量。

3.結(jié)果和討論：

已有文獻(xiàn)研究表明[4]，一定濃度的肝素與亞甲藍(lán)反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)在566nm處和664nm處各檢測(cè)到一個(gè)特征吸收峰，如圖5[4]所示，紫外吸光度隨肝素含量增加而發(fā)生變化，所以通過(guò)對(duì)已知含量的肝素鈉（鋰）溶液測(cè)得的吸光度對(duì)肝素含量作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到樣品中肝素的含量。而在相同實(shí)驗(yàn)條件下，664nm處的峰值變化比566nm處的峰值變化靈敏一倍，本次實(shí)驗(yàn)在664nm處進(jìn)行測(cè)試。

1、帶負(fù)電荷的肝素陰離子與亞甲藍(lán)發(fā)生締合反應(yīng)，通過(guò)吸光度計(jì)算得到肝素鈉和肝素鋰含量，計(jì)算所得結(jié)果重復(fù)性較好，偏差較小。

2、0.05 IU/ml～0.25 IU/ml的濃度范圍內(nèi)[3]的肝素鈉和肝素鋰的紫外吸光度與其相對(duì)應(yīng)的肝素含量均具有良好的線性關(guān)系，并具有良好的重復(fù)性。

3、相同濃度肝素鈉、肝素鋰所測(cè)得的紫外吸光度值相近，肝素鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線也可以進(jìn)行肝素鋰含量的測(cè)定。用肝素鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的肝素鋰含量，與肝素鋰標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的肝素鋰含量結(jié)果相近，誤差在可接受范圍內(nèi)。

4.結(jié)論

對(duì)肝素產(chǎn)品進(jìn)行肝素含量測(cè)定時(shí)，用肝素鈉作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同樣可以準(zhǔn)確得到樣品中肝素鋰的含量，由于肝素鈉、肝素鋰在于亞甲藍(lán)發(fā)生反應(yīng)時(shí)，是肝素陰離子與亞甲藍(lán)的絡(luò)合，陽(yáng)離子對(duì)其不產(chǎn)生影響，據(jù)此推測(cè)，本方法在測(cè)定其他肝素產(chǎn)品的含量時(shí)也有參照作用，用不同于樣品的其他肝素標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中肝素的含量。這對(duì)不易購(gòu)買(mǎi)到標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)肝素樣品的測(cè)定提了供較為方便可靠的操作方法，在對(duì)采血管的肝素含量檢測(cè)中提供了更高效便捷的操作方法，在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，提高檢測(cè)效率，具有廣泛的應(yīng)用意義。

[1] 方井晉.肝素鈉有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法學(xué)研究及效價(jià)的快速測(cè)定[D].浙江大學(xué),2012.

[2] 劉秀英,張超燦,徐衛(wèi)林.甲苯胺藍(lán)分光光度法測(cè)定肝素鈉的研究[J].化學(xué)試劑,2009,3(4):271-274.

[3] 柳軼男,莫秀梅,何創(chuàng)龍,等.甲苯胺藍(lán)法測(cè)定肝素鈉含量的校準(zhǔn)曲線研究[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2009,26(2):278-280.

[4] Jiao QC,Liu Q,Sun C,et al.Investigation on the binding site in heparin by spectrophotometry [J].Talanta,1999,48(5):1095–1101.

Research on Detemination of Heprin by UV Spectrophotometry

ZHANG Yun HUANG Min-ju YUAN Qin LI Ji-yan Guangzhou Medical Instruments Quality Supervision and Inspection Center of State Food and Drug Adiminastration
(Guangdong Guangzhou 510663)

According to the reaction btween heparin sodium and methylene blue, there is the absorption peaks at 664nm. The content of heparin and its absorbance keep a linear relation , so we can utilize UV spectrophotometry standard curve to caculate the results of heparin sodium. The method has been applied to analyze the samples and the results are satisfactory.

heparin, methylene blue, spectrophotometry, blood collection tube

1006-6586(2017)14-0019-03

R927.2

A

2017-06-22