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        液相色譜測(cè)定單糖與二糖和低聚半乳糖的方法研究

        2017-08-22 22:55:30車永進(jìn)岳子賀戚克進(jìn)
        科技資訊 2017年20期
        關(guān)鍵詞:液相色譜測(cè)定單糖

        車永進(jìn)+岳子賀+戚克進(jìn)

        摘 要:目前有多種方法可以測(cè)定低聚糖中各種組分的含量,包括毛細(xì)管電泳定量分析、氣相色譜法、薄層層析法]和高壓液相色譜法,其中高壓液相色譜法因操作方便、分析速度快而被廣泛應(yīng)用。高壓液相色譜法又根據(jù)檢測(cè)器的不同分為:紫外可見光二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)(UV-DAD)、脈沖安培檢測(cè)器定量分析、和示差折光檢測(cè)器檢測(cè)[等。該研究采用高壓液相色譜分析,示差折光檢測(cè)器檢測(cè),嘗試采用Zorbax Carbohydrate柱、Aichrom-NH2和Sugar Pak Ι三種色譜柱同時(shí)檢測(cè)樣品中的葡萄糖、乳糖和低聚半乳糖中三糖、四糖和五糖,確定最佳的色譜分析柱和色譜操作條件。

        關(guān)鍵詞:液相色譜 測(cè)定 單糖 二糖 低聚半乳糖

        中圖分類號(hào):TH86 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1672-3791(2017)07(b)-0108-02

        由于人體腸道內(nèi)不具備分解消化低聚半乳糖的酶系統(tǒng), 因而低聚半乳糖在體內(nèi)不能被胃酸和胃酶降解, 故不能被消化吸收, 而是直接進(jìn)入小腸內(nèi)被有益菌尤其是雙歧桿菌利用, 對(duì)人體發(fā)揮獨(dú)特的生理功能,因此被定義為“益生元”,它能有效促進(jìn)體內(nèi)雙歧桿菌的生長繁殖,改善脂質(zhì)代謝,促進(jìn)鈣的吸收和維生素的合成,具有分解致癌物質(zhì)、提高人體免疫力等功能。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與材料

        儀器:高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);電子天平AR3130(奧豪斯儀器(上海)有限公司);液相色譜柱分別為Zorbax Carbohydrate(4.6×150 mm,美國安捷倫科技有限公司)、氨基柱Aichrom-NH2(4.6×250 mm,美國Abel工業(yè)有限公司)和Sugar Pak Ι(4×300 mm,美國Waters公司)。

        材料:葡萄糖、乳糖由美國sigam公司提供,低聚半乳糖(其中含半乳三糖、四糖和五塘)由煙臺(tái)華海生物制品有限提供。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 色譜柱的選擇

        各種糖組分的含量分析采用高效液相色譜法。色譜系統(tǒng)為美國安捷倫公司提供的Agilent 1200,色譜柱分別為Zorbax Carbohydrate(4.6×150 mm,美國安捷倫公司)、氨基柱Aichrom-NH2(4.6×250 mm,美國Abel工業(yè)有限公司)和Sugar Pak Ι(4×300 mm,美國Waters公司)。如果沒有特別說明,則色譜條件為:G1362A 示差折光檢測(cè)器,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,柱溫25 ℃,前面兩種柱子采用乙腈與水的混合液為流動(dòng)相,調(diào)整流動(dòng)相組成使其達(dá)到最佳分離效果;Sugar PakⅠ的流動(dòng)相為雙蒸蒸餾水。

        1.2.2 流動(dòng)相組成的選擇

        流動(dòng)相為乙腈與水的混合物,體積比分別為65∶35、70∶30和75:25,比較不同流動(dòng)相組成對(duì)分離效果的影響。

        1.2.3 洗脫流速的選擇

        洗脫流速分別為0.5、1和1.5 mL/min,比較不同的洗脫流速對(duì)分離效果的影響。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 色譜柱的選擇

        Zorbax Carbohydrate、Aichrom-NgH2、Sugar Pak Ι中的三種色譜柱都能夠有效地分離低聚半乳糖中的各種組分,進(jìn)行定性或定量測(cè)定。但Sugar Pak Ι柱在使用一段時(shí)間后,柱效很快降低,可能是因?yàn)镾ugar Pak Ι中的固定相為鈣型陽離子交換樹脂,低聚半乳糖樣品中存在的少量陽離子(原料生產(chǎn)時(shí)緩沖溶液中的少量離子,或用少量NaOH調(diào)整 pH值時(shí)帶入的鈉離子)很容易將固定相樹脂中的鈣離子置換下來,不但嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性,而且大大降低色譜柱的使用壽命,并且Sugar Pak Ι的價(jià)格約是另外兩種柱子的3倍,因此,該研究中糖溶液不適宜用Sugar Pak Ι進(jìn)行分析。

        氨基柱Zorbax Carbohydrate 和Aichrom-NgH2價(jià)格相當(dāng),實(shí)驗(yàn)條件下分析低聚半乳糖混合物,Zorbax Carbohydrate柱比Aichrom-NH2出峰快,分析時(shí)間短,色譜柱的理論塔板數(shù)高。雖然兩種柱子對(duì)各種糖組分的選擇性相差不大,但前者分離各種糖組分的分離度明顯高于后者;采用Aichrom-NH2柱分析,只對(duì)葡萄糖和乳糖的分離度超過了1.5,其他各種糖組分之間的分離度都小于1.5。因此氨基柱Zorbax Carbohydrate的分離效果更好,故該研究后面的實(shí)驗(yàn)都采用Zorbax Carbohydrate柱對(duì)低聚半乳糖進(jìn)行定性和定量分析測(cè)定。

        2.2 流動(dòng)相組成的確定

        色譜條件:Zorbax-Carbohydrate色譜柱(4.6×150 mm),柱溫25 ℃,G1362A示差檢測(cè)器,流動(dòng)相流速1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,流動(dòng)相為乙腈與水的混合物,體積比分別為65∶35、70∶30和 75∶25,得到不同流動(dòng)相組成對(duì)低聚半乳糖的分離效果。

        隨著流動(dòng)相中乙腈含量的增加,流動(dòng)相的非極性增強(qiáng),各種糖組分在柱中的保留時(shí)間增加,分離度增大。乙腈與水的比例為65∶35時(shí),分析一個(gè)樣品只需要7 min,流動(dòng)相比例為75∶25時(shí),分析一個(gè)樣品需17 min。但從上述結(jié)果可以看出,流動(dòng)相比例為65∶35的選擇性和分離度也最小,只有葡萄糖和乳糖之間的分離度大于1.5,其他各種糖組分之間的分離度都小于1.5,而流動(dòng)相比例為70∶30和75∶25的分離度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.5,并且分離度和選擇性相差不大,而前者比后者出峰時(shí)間早,分析一個(gè)樣品可以節(jié)約5 min,故確定最佳的流動(dòng)相比例為70∶30。

        2.3 流動(dòng)相流速的確定

        流動(dòng)相的流速影響塔板高度,從而影響分離效果。流動(dòng)相流速太快,柱效降低,但流速太慢,又會(huì)因增加擴(kuò)散而降低分離度。該研究分別考察了流動(dòng)相流速分別為0.5、1.0和1.5 mL / min的分離效果。

        可以看出:流動(dòng)相的流速越大,出峰越快,色譜峰越窄,分離的理論塔板數(shù)越多,同時(shí)選擇性越小,分離度也越小。但3個(gè)流速下的分離度均大于1.5,這表明各種糖組分都已完全分離。相比之下,流速為1.0和0.5 mL/min時(shí),其分離度和選擇性均優(yōu)于1.5 mL/min,而且柱壓較低。1.0和0.5 mL/min的分離度和選擇性相差不大,而1.0 mL/min的出峰速度快,分析一個(gè)樣品比后者要節(jié)約10 min,故取1.0 mL/min為最佳洗脫流速。

        3 結(jié)語

        根據(jù)色譜柱同時(shí)分離單糖、二糖和低聚半乳糖組分的分離度和選擇性,以及色譜柱的價(jià)格和使用壽命,確定安捷倫公司的Zorbax Carbohydrate 柱可以很好地定性分析和定量測(cè)定單糖、二糖和低聚半乳糖混合物中各種組分的含量。最佳的色譜分離條件為:采用示差折光檢測(cè)器檢測(cè),流動(dòng)相為乙腈與水的混合物,體積比70∶30;洗脫流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

        參考文獻(xiàn)

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