周偉東+周勇+劉奕+張立強+鄧平+艾桃山+曾令兵+喻運珍+喻婷

摘要：以ISKNV MCP基因為目的基因，克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建成DNA疫苗pcMCP，對鱖魚（Siniperca chuatsi）pcMCP DNA疫苗進(jìn)行浸泡免疫效果研究。結(jié)果表明，pcMCP DNA疫苗能夠刺激免疫系統(tǒng)，對非特異性免疫和IgM的表達(dá)都具有激活作用。免疫后血液中白細(xì)胞含量、白細(xì)胞吞噬能力和SOD活力都顯著提高，14 d時均達(dá)到最大。IgM和Mx基因的mRNA表達(dá)研究顯示，72 h大量表達(dá)，96 h達(dá)到最大，分別是對照組的3.05倍和2.02倍。攻毒試驗顯示，浸泡免疫能夠有效保護(hù)ISKNV感染的鱖魚，在第11天，浸泡免疫組的累計死亡率僅為40%，而對照組死亡率都達(dá)到了100%，pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鱖魚死亡率。

關(guān)鍵詞：鱖魚（Siniperca chuatsi）；DNA疫苗；浸泡免疫；傳染性脾腎壞死病毒

中圖分類號：S942.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）14-2731-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.034

Abstract：In this study， ISKNV MCP gene was cloned into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1（+） to construct DNA vaccine，pcMCP，to study the immune effect of DNA vaccine. The results showed that immersion immunity by pcMCP DNA vaccine could stimulate the immune system. After immunization，White blood cell content，leukocyte phagocytosis and SOD were significantly improved，and they reached the maximum at 14th day. The mRNA level of IgM and Mx gene was expressed at 72 h，and reached the maximum at 96 h， and they were upto 3.05 fold and 2.02 fold respectively，compared with control group. Challenge test， immersion immunization could effectively protect the ISKNV infected mandarin fish. at the eleventh day，the total death rate of immersion immunization groupwas only 40%， the control groups were mortality rate reached 100%. So these results showed that immersion immunity of DNA vaccine reduced death of ISKNV infected Mandarin fish.

Key words：mandarin fish（Siniperca chuatsi）； DNA vaccine； immersion immunization； infectious spleen and kidney necrosis virus

病毒性疾病對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的損失呈上升趨勢，且大多缺乏針對性的治療藥物和手段，疫苗防控作為疾病控制方法越來越受到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重視[1，2]。目前，大量使用的注射免疫方式使得水產(chǎn)疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用和推廣受到了很大的限制。因此，開發(fā)使用簡單、成本低廉的DNA疫苗和免疫方式對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)尤為重要。研究表明，基于黏膜系統(tǒng)的疫苗能夠提高病原體感染后試驗動物的生存能力[3，4]。DNA疫苗不僅能夠通過黏膜系統(tǒng)使魚體產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)力，同時還能夠刺激機體非特異性免疫產(chǎn)生額外的免疫保護(hù)力[5-8]。

鱖魚病毒病對中國的鱖魚養(yǎng)殖業(yè)造成很大危害，其主要病原是傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）。目前，鱖魚病毒病還沒有特效藥物，仍以預(yù)防為主，通過水質(zhì)調(diào)節(jié)，免疫增強為主，疫苗防治為鱖魚養(yǎng)殖業(yè)急需。由于鱖魚是肉食性魚類，性格暴躁，只吃活魚，口服或注射的免疫方式很難在鱖魚養(yǎng)殖中使用，疫苗浸泡免疫是鱖魚免疫的惟一選擇。Fernandez-Alonso等[9]在鱒魚上利用DNA疫苗浸泡免疫預(yù)防出血性敗血癥病毒的研究中，浸泡組在第35天的死亡率比對照組降低了36%。ISKNV主要衣殼蛋白（Major capside protein，MCP）是病毒粒子的主要抗原蛋白，本研究克隆了ISKNV MCP基因，構(gòu)建了重組MCP基因的DNA疫苗（pcMCP），并對鱖魚苗進(jìn)行浸泡免疫，免疫后血液中白細(xì)胞含量、白細(xì)胞吞噬能力和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）都顯著提高，IgM和Mx基因的mRNA在72 h大量表達(dá)，pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鱖魚死亡率。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

鱖魚購自武漢佳恒水產(chǎn)鱖魚繁殖廠，體重40～50 g，試驗水池內(nèi)暫養(yǎng)，水溫25 ℃，連續(xù)通氣。

1.2 DNA疫苗的構(gòu)建

以ISKNV核酸為模板，利用表1中的引物P1和P2擴增MCP基因全長序列，表中下劃線表示限制性內(nèi)切酶Kpn I和 EcoR I的酶切位點。將PCR產(chǎn)物MCP基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建DNA疫苗真核表達(dá)質(zhì)粒pcMCP。

1.3 MCP基因在鯉魚上皮瘤細(xì)胞中的表達(dá)

將鯉魚上皮瘤細(xì)胞（Epithelioma papulosum cyprini，EPC）接種在6孔板中，用含10%牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層后，通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，將重組質(zhì)粒pcMCP轉(zhuǎn)染到EPC細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后72 h將細(xì)胞用4%多聚甲醛于4 ℃固定，以兔抗MCP多克隆抗體為一抗，紅色熒光探針標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）抗體為二抗，DAPE為細(xì)胞核染色劑，參照免疫熒光染色試劑盒（Beyotime，免疫熒光染色試劑盒—抗兔Cy3）對轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的EPC細(xì)胞進(jìn)行檢測。同時用轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1（+）的EPC細(xì)胞作為對照進(jìn)行相同操作。

1.4 血細(xì)胞計數(shù)和白細(xì)胞吞噬活性

取樣采血后，立即用事先配制的Dacie液稀釋血液，血球計數(shù)板計血細(xì)胞數(shù)[紅細(xì)胞（Blood cell，RBC）與白細(xì)胞（White blood cell，WBC）]，重復(fù)計數(shù)3次。將金黃色葡萄球菌菌液（Staphylococcus aureus）加入終濃度為0.3%的福爾馬林溶液，恒溫水浴鍋28 ℃滅活48 h，即濃度為1×108 CFU/mL的金黃色葡萄球菌，作為吞噬原，置于4 ℃冰箱備用。0.2 mL抗凝血中加入0.05 mL經(jīng)福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌，充分混勻后置25 ℃恒溫水浴鍋中孵育60 min，每10 min搖勻1次，1 000 r/min離心10 min，吸取白細(xì)胞層制涂片3張。Wright-Giemsa染液混合染色，油鏡下觀察。吞噬活性以吞噬百分比（Phagocytic percentage，PP），計算公式為：PP=N100/100×100%；N100指100個吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)。

1.5 SOD活力測定

使用超氧化物歧化酶試劑盒（購于南京建城生物工程研究所）進(jìn)行測定，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。

1.6 RT-PCR檢測樣品中IgM和Mx基因表達(dá)量

利用熒光定量PCR分析免疫鱖魚魚體免疫相關(guān)基因（Mx、IgM）的表達(dá)差異。分別在浸泡免疫后12、24、48、72、96 h采樣，每組隨機取3尾魚，解剖取其脾臟組織，用Trizol（Invitrogen）提取樣品中的總RNA，經(jīng)DNase Ⅰ消化后，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。按照Realtime PCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒中的操作說明，在AB Plus one熒光定量PCR儀上對所取的試驗樣品進(jìn)行RT-PCR。

1.7 免疫保護(hù)試驗

將健康鱖魚（40～50 g）隨機分為2組，每組30尾，即對照組和免疫組。免疫組浸泡于濃度為100 ng/mL pcMCP質(zhì)粒的免疫浸泡液中30 min，對照組浸泡于PBS溶液中，浸泡免疫后25 ℃恒溫養(yǎng)殖，投喂鯪魚。免疫后第28天進(jìn)行攻毒試驗，各組每尾魚通過腹腔注射10×TCID50 ISKNV，連續(xù)觀察15 d，記錄感染發(fā)病和死亡情況，計算相對免疫保護(hù)率（Relative percent survival，RPS）。RPS=[1-（免疫組死亡率/對照組死亡率）]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 pcMCP的重組質(zhì)粒構(gòu)建及真核表達(dá)

以鱖傳染性脾腎壞死病毒主衣殼蛋白MCP基因為目的基因，利用MCP特異性引物PCR擴展MCP基因，插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建成DNA疫苗pcMCP。PCR鑒定結(jié)果顯示，大小約為1 300 bp的ISKNV MCP基因成功克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）上（圖1A）。

脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)真核重組質(zhì)粒pcMCP轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72 h間接熒光免疫試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的EPC細(xì)胞胞質(zhì)中可觀察到紅色熒光見圖1B。同時用pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞作為對照進(jìn)行間接熒光免疫試驗，未發(fā)現(xiàn)任何熒光。這表明成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcMCP能夠在EPC細(xì)胞中表達(dá)。

2.2 鱖魚血液中白細(xì)胞數(shù)目和吞噬活性分析

經(jīng)DNA疫苗浸泡免疫后，免疫組鱖魚白細(xì)胞變化趨勢計數(shù)結(jié)果如圖2A所示。DNA浸泡免疫后，鱖魚外周血白細(xì)胞數(shù)目都有不同程度的增加，其中14 d和21 d浸泡組白細(xì)胞顯著高于對照組（P<0.05）。白細(xì)胞吞噬試驗結(jié)果（圖2B）顯示，在7～21 d浸泡免疫組中白細(xì)胞吞噬滅活的金黃色葡萄球菌的吞噬百分比顯著高于對照組（P<0.05），第28天的浸泡免疫組的吞噬百分比高于對照組，但差異不顯著。同時還發(fā)現(xiàn)，鱖魚白細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞存在吞噬多個滅活的金黃色葡萄球菌的現(xiàn)象。

2.3 對血清超氧化物歧化酶活性的影響

SOD活力檢測結(jié)果如圖3所示，免疫后鱖魚血清中SOD活力與對照相比有所提高，其中7 d和14 d浸泡免疫組SOD活力顯著高于對照組（P<0.05），21 d和28 d浸泡免疫組SOD酶活比對照組有所提高，但差異不顯著。

2.4 浸泡免疫對IgM和Mx基因表達(dá)的影響

實時定量PCR檢測DNA疫苗浸泡免疫對鱖魚脾臟中IgM mRNA表達(dá)變化如圖4，在浸泡免疫后48 h內(nèi)，IgM mRNA表達(dá)量與對照組幾乎沒有變化，72 h后IgM mRNA表達(dá)量逐步升高，72 h IgM mRNA表達(dá)量是PBS組的2.04倍，96 h達(dá)到3.05倍。DNA疫苗浸泡免疫能夠有效激活鱖魚體液免疫。

RT-PCR檢測DNA疫苗浸泡免疫對鱖魚脾臟中Mx mRNA表達(dá)變化如圖5，浸泡免疫后12 h和24 h，脾臟中Mx mRNA的表達(dá)量略低于PBS組， 72 h和96 h的Mx mRNA表達(dá)量分別是PBS組的1.45倍和2.02倍。隨時間的增加，浸泡免疫組Mx基因表達(dá)量逐步增加。

2.5 ISKNV DNA疫苗浸泡免疫的保護(hù)效果

用10×TCID50 ISKNV攻毒后，免疫組與對照組在11 d內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的死亡，死亡時間集中在攻毒的第5天后，如圖6所示。DNA疫苗浸泡免疫鱖魚后產(chǎn)生了較高的免疫力，PCR檢測死亡鱖魚為ISKNV陽性，同時觀察其發(fā)病癥狀，與自然環(huán)境下感染ISKNV發(fā)病癥狀相同，表明其死亡原因是由于人工感染ISKNV所致。免疫后第11天，ISKNV DNA疫苗浸泡免疫組累計死亡率40%，空質(zhì)粒pcDNA3.1（+）和PBS對照組累計死亡率為100%。

3 討論

魚類的嗜中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞已被證實有很強的吞噬能力，白細(xì)胞的吞噬作用是魚類非特異免疫的重要組成部分[10]。通過對鱖魚進(jìn)行DNA疫苗浸泡免疫，鱖魚白細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞吞噬百分比與對照組相比都有所增加，而且白細(xì)胞中大量存在一個白細(xì)胞吞噬多個金黃色葡萄球菌的現(xiàn)象。pcMCPE DNA疫苗浸泡免疫后，鱖魚吞噬細(xì)胞的吞噬活性被提高。除此之外，魚類的紅細(xì)胞也有一定的吞噬活性，本研究在鏡檢中也觀察到了許多紅細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象，由此可見鱖魚的紅細(xì)胞在免疫反應(yīng)中也發(fā)揮了一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

SOD常作為動物體極為重要的一類非特性免疫因子，在各種需氧生物體內(nèi)廣泛存在，它可以抑制和清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，屬于機體內(nèi)的防御系統(tǒng)酶類。SOD活力與機體的免疫水平密切相關(guān)，對增強巨噬細(xì)胞的防御功能和整個機體的免疫機能發(fā)揮著十分重要的作用[11]。本研究顯示，浸泡免疫可以提高血清SOD活力，免疫后7～14 d的血清SOD活力顯著高于對照組。

Mx蛋白是一類由I型干擾素（IFN）誘導(dǎo)表達(dá)的抗病毒蛋白，當(dāng)機體或細(xì)胞受到病毒感染時，能與其他干擾素誘導(dǎo)的蛋白一起形成體內(nèi)抗病毒感染的防線，以達(dá)到抗病毒的目的。本研究結(jié)果表明，浸泡免疫后鱖魚脾臟中Mx mRNA相對表達(dá)量隨時間呈上升趨勢，72 h和96 h的Mx mRNA含量分別是對照組的1.45倍和2.02倍。DNA疫苗浸泡免疫后，IgM mRNA表達(dá)含量隨時間呈上升趨勢，與對照組比 72 h達(dá)到2.04倍，96 h達(dá)到3.05倍。pcMCP DNA疫苗浸泡免疫能夠激活天然免疫和特異性免疫。在本研究中Mx和IgM mRNA大量表達(dá)出現(xiàn)在72 h，疫苗刺激的效應(yīng)基因表達(dá)較晚，可能是因為DNA疫苗浸泡后的細(xì)胞攝入、抗原表達(dá)、加工、識別，以及免疫效應(yīng)分子的表達(dá)都需要一定的時間。本研究結(jié)果與斜帶石斑魚、牙鲆免疫浸泡后IgM基因的表達(dá)相一致[12，13]，結(jié)合之前的相關(guān)報道，IgM表達(dá)高峰出現(xiàn)時間可能與魚的種類、疫苗、免疫方式等有關(guān)，DNA疫苗浸泡免疫的產(chǎn)生要晚于蛋白疫苗免疫。

通過對免疫后的鱖魚攻毒試驗顯示，DNA疫苗浸泡組在免疫后第11天的累計死亡率為40%，而未免疫組在第11天已經(jīng)全部死亡，對照組死亡時間主要集中在5～9 d，這與Mx基因和IgM基因在第3天后大量表達(dá)相一致。

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