周艷，曹頂國

(山東省農業(yè)科學院家禽研究所，山東省家禽育種工程技術研究中心，山東濟南250023)

雞miR NA的研究進展*

周艷，曹頂國**

(山東省農業(yè)科學院家禽研究所，山東省家禽育種工程技術研究中心，山東濟南250023)

miRNA(microRNA)是一類非編碼的、長度約為21～26nt的單鏈小分子RNA。miRNA廣泛存在于真核生物中，序列特異、高度保守。近來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛參與有機體各個生物學過程，本文就miRNA的發(fā)現(xiàn)、作用機制以及在雞生長發(fā)育、生殖以及疫病中的研究進展進行綜述。

1 miRNA發(fā)現(xiàn)

1993年，VictorAmbros,ColleaguesRosalind Lee和Rhonda Feinbaum首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)lin-4，其產生2個小RNA轉錄本。一個轉錄本長度約22nt，另外一個約61nt。通過與Lin-14基因3' UTR的互補序列結合從而調控lin-14的表達[1-2]。Reinhart BJ.等(2000)在線蟲中發(fā)現(xiàn)let-7編碼21核苷酸RNA，并且在lin-14、lin-28、lin-41、lin-42 and daf-12基因3'UTR有互補元件，同lin-4一樣對線蟲發(fā)育具有時空調節(jié)作用[3]。隨后Lagos-Quintana等[4]Lau等[5]、Lee and Ambros[6]于2001年分別發(fā)表了在果蠅、人和蠕蟲中發(fā)現(xiàn)的大約20個、30個和60個大量表達的、類似lin-4和let-7長度的小RNAs，稱之為microRNA(miRNA)。

現(xiàn)代分子技術尤其是高通量測序技術的出現(xiàn)以及生物信息學的發(fā)展，為miRNA的研究提供了前所未有的平臺，大量的成熟miRNAs和前體小RNA被鑒定出來。2014年6月，miRBase數(shù)據(jù)庫正式發(fā)布了21.0版本，包含223個物種的35828條成熟miRNA信息。與20.0版本相比更新了大量的數(shù)據(jù)，miRNAs發(fā)夾前體序列新增4196條，成熟miRNAs新增5441條，包括17個物種的第一個miRNAs。169條發(fā)夾前體序列和353條成熟序列更新名稱。72條錯誤注釋和重復序列被刪除。其中雞[Gallus gallus]發(fā)夾前體miRNAs序列達740條，成熟miRNAs序列994條，部分物種的miRNA數(shù)見表1。

表1 部分物種的miRNA種類數(shù)

2 miRNA的特征

miRNA一般具有以下幾個特征：①長度通常在21～26nt；②是內源性、非編碼的小RNA分子，不具有開放閱讀框；③成熟miRNA的序列在鄰近物種甚至不同物種間具有高度進化保守性[4,7]；④廣泛存在于真核生物中，表達具有嚴格的組織特異性和時空性[8-9]；⑤成熟miRNA都是由長度為60～80nt、具有莖環(huán)結構的前體經(jīng)過Dicer酶剪切加工而來[10-11]。

3 miRNA的作用機制及功能

miRNA通過與靶基因3'UTR上存在的不完全或者完全互補位點結合來抑制靶基因的翻譯或降解靶mRNA[12-13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)在靶基因的5'端或者編碼區(qū)也存在miRNA的結合位點，而且miRNA對靶基因的作用不僅限于翻譯抑制和降解，在某些情況下可能對靶基因的翻譯和轉錄起正調控作用。已有研究表明miRNA主要與細胞增殖[14]、凋亡[15-16]、神經(jīng)發(fā)育[17]、造血過程[18-19]，以及與人類的某些疾病如癌癥[20-21]、心血管病[22-23]等相關。

4 雞miRNA的相關研究

作為重要調控因子，miRNA在家禽中的功能研究也成為熱點，已有研究表明其在雞生長發(fā)育、生殖、疫病等重要生物學過程均發(fā)揮重要作用。

4.1 miRNA與雞生長發(fā)育miRNA廣泛參與雞胚早期生長、發(fā)育、細胞增殖、分化等一系列生命過程。2006年，Darnell等采用高通量原位雜交技術發(fā)現(xiàn)在雞胚器官形成過程中有部分miRNAs表達快速上調[24]。2008年，Glazov等[25]和Hicks等[26]均構建了雞胚不同發(fā)育時間段的miRNAs文庫，分別新發(fā)現(xiàn)了449個和14個新的miRNAs。除了在雞胚生長中發(fā)揮作用外，Hicks等(2009)進一步研究了miRNAs在雞免疫器官形成中的作用，證實miRNAs與法氏囊和淋巴細胞發(fā)育分化有關[27]。此外，miRNAs被發(fā)現(xiàn)在雞骨骼肌、胸肌生長和脂肪沉積中均發(fā)揮重要的調控作用。Li等(2011)研究了蛋雞和肉雞骨骼肌中miRNAs的表達情況，發(fā)現(xiàn)了17個miRNAs在蛋雞和肉雞的骨骼肌中差異表達，這些miRNAs的部分靶基因與肌肉形成有關[28]。Lin等(2012)年比較了矮小型雞和正常雞的骨骼肌中的miRNAs表達，發(fā)現(xiàn)miR-1623,miR-181b，let-7b和miR-128的表達量存在差異，進一步研究發(fā)現(xiàn)let-7b通過與生長激素受體基因(GHR)的3'端結合，調控GHR的表達。細胞因子信號3基因(SOCS3)通過let-7b介導GHR的表達，對骨骼肌生長和脂肪沉積發(fā)揮重要的調控作用[29]。Ouyang H等（2015）比較了隱性白洛克雞和杏花雞胸肌中的miRNAs表達，共發(fā)現(xiàn)921個miRNAs、miR-34c、miR-223、miR-146b-3p、miR-21和miR-205a被認為是調控雞生長的功能miRNAs[30]。

4.2 miRNA與雞性別分化及卵巢卵泡發(fā)育近來研究表明，多個miRNAs參與雞早期性腺發(fā)育和性別分化及卵巢卵泡發(fā)育等生殖相關的生物學過程。Bannister等(2009)采用基因芯片研究發(fā)現(xiàn)MIR202*在雞胚睪丸發(fā)育過程中表達上調[31]。隨后其采用雌激素誘導的性別轉換模型再次表明，MIR202*表達下調，則導致睪丸相關基因DMRT1和SOX9表達下調，卵巢相關基因FOXL2和CYP19A1(aromatase)表達上調。相反，MIR202*表達上調，則導致睪丸相關基因DMRT1和SOX9表達上調，卵巢相關基因FOXL2和CYP19A1 (aromatase)表達下調，證明MIR202*表達上調與雞胚性腺分化和睪丸發(fā)育過程一致[32]。此外ggamiR-363[33]和gga-miR-551b和gga-miR-1599[34]都被發(fā)現(xiàn)可能涉及早期雞胚性腺發(fā)育過程。Cutting等(2012)也發(fā)現(xiàn)miR-101在公雞中高表達，但是在性腺分化后的母雞中表達顯著增加[35]。此外，多個miRNAs被鑒定參與雞卵巢卵泡發(fā)育，Kang等(2013)采用Illumina/Solexa測序技術對雞性成熟前后卵巢中的miRNAs進行了鑒定，獲得了203個在雞卵巢表達的miRNAs，其中有93個在性成熟前后的卵巢中表現(xiàn)出顯著差異表達[36]。本課題組采用Illumina Solexa測序方法分析高、低汶上蘆花雞個體卵巢組織中差異表達的miRNAs。以低產雞卵巢為對照，在高產雞卵巢中共篩選到72個差異表達miRNAs，其中13個表達上調，59個表達下調[37]。

4.3 miRNA與雞疫病發(fā)生作為功能廣泛的調控因子，miRNAs在雞馬立克氏病、禽流感、支原體、法氏囊等疾病發(fā)生過程中同樣發(fā)揮重要的調控作用。Burnside等(2008)采用深度測序技術分別檢測了馬立克氏病毒(MDV)感染的和未感染的雞胚胎成纖維細胞(CEF)的miRNAs表達量，結果表明let-7和miR-199a-1等miRNAs在腫瘤細胞中低表達[38]。Lian等(2012)發(fā)現(xiàn)在MDV感染的腫瘤脾臟和肝臟淋巴瘤中，gga-miR-181a、gga-miR-26a、gga-miR-221、gga-miR-222、gga-miR-199*和gga-miR-140*表達下調，gga-miR-146c表達上調[39]。2015年，Li等證實gga-miR-26a靶向NEK6抑制MDV細胞增殖[40]。隨后gga-miR-130a[41]和gga-miR-219b[42]分別被發(fā)現(xiàn)通過靶基因抑制MDV細胞增殖。

Wang等(2012)研究了禽流感病毒(AIV)感染的肉雞肺部的miRNAs表達情況，發(fā)現(xiàn)108個在AIV感染的肺部高表達，而只有13個在對照中高表達，該結果與蛋雞中的趨勢相反，因此蛋雞和肉雞中關于AIV感染的宿主免疫應答調控機制可能不同。多重比較分析結果表明，gga-miR-34a、122-1、122-2、146a、155、206、1719、1594和1599是肉雞肺部AIV感染的宿主免疫應答調控的重要候選miRNAs[43]。Peng等2015研究了感染和非感染H9N2雞胚成纖維細胞中的miRNAs，結果發(fā)現(xiàn)了48個差異表達miRNAs，其中gga-miR-146c、gga-miR-181a、gga-miR-181b、gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-30e和gga-miR-455被發(fā)現(xiàn)在其他類型的禽流感病毒感染的細胞中也差異表達[44]。在A549細胞中，miR-584-5p和miR-1249被發(fā)現(xiàn)下調PB2的表達從而抑制H5N1和H1N1的復制[45]。Zhao等（2017）發(fā)現(xiàn)gga-miR-99a通過靶向SMARCA5在雞支原體感染中發(fā)揮重要作用[46]。歐陽偉等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，在傳染性法氏囊病病毒(IBDV)弱毒感染的CEF中，有17個表達上調，17個表達下調，在IBDV強毒感染雞法氏囊組織細胞中，30個表達上調，18個表達下調。結果表明，IBDV感染可導致內源性miRNAs表達發(fā)生變化，從而調控細胞內多種代謝和信號傳導途徑發(fā)生異常，引起細胞及組織器官發(fā)生病理學變化[47]。ggamiR-2127也被發(fā)現(xiàn)通過下調雞p53調控IBDV天然免疫反應[48]。

5 展望

雞miRNA研究的廣泛開展使人們對其功能和發(fā)揮的作用有了更多的認識和理解。但是目前鑒定的miRNA大多局限于與某種生物學過程相關或者單一靶基因的鑒定，而一個miRNA可同時調控上百個基因，一個基因也可以同時受到多個miRNAs的調控，因此單一調控關系鑒定無法準確闡述其對生物學過程的調控機制。只有全面深入的解析miRNA多元化的調控網(wǎng)絡，才能更好的闡明其在雞重要經(jīng)濟性狀中發(fā)揮的調控作用，而這也將是下一步的研究重點。

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([33-48]參考文獻省略，如有需要請聯(lián)系本編輯部。)

Q753

A

1673-1085（2017）08-0050-04

2017-07-19

山東省自然基金重點項目（ZR2014CZ003）；山東省自然基金（ZR2014YL024）；山東省農科院青年基金（2014QNM14）。

周艷（1979-），女，漢，山東新泰人，副研究員，博士，主要研究方向：家禽遺傳育種。

**通訊作者：曹頂國(1973-)，男，漢，山東嘉祥人，研究員，主要研究方向：家禽遺傳育種，Email：cdgjqs@163.com。