孫森鳳，張穎穎

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟南 250355； 2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟南 250355)

瓦松總黃酮的提取及其抑菌效果

孫森鳳1，張穎穎2

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟南 250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟南 250355)

目的：提取瓦松總黃酮并對其總黃酮含量進行測定，進一步觀察總黃酮的抑菌效果。方法：采用超聲法提取瓦松總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度法測總黃酮的含量；并參照NCCLS規(guī)范，用微量稀釋法來測定總黃酮最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果：測定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性良好，R2=0.999 2，線性范圍在0.02～0.6 mg/mL。瓦松總黃酮對福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株抑菌效果最好，對部分臨床分離金黃色葡萄球菌耐甲氧西林株(MRSA)、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸埃希菌及其臨床分離株、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株及其臨床分離株抑菌效果較好，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最弱。瓦松水提物抑菌趨勢與總黃酮一致性較差，總黃酮及水提物均無明顯的MBC。結(jié)論：瓦松總黃酮及其水提物對本試驗選取的菌株均有一定的抑制作用，且抑制作用較好。黃酮好于水提物，作用機制以抑制為主，而非直接殺菌。瓦松總黃酮具有較好的抑菌效果，在食品開發(fā)上有較高研究價值。

瓦松總黃酮；抑菌活性；MIC；MBC

瓦松為景天科植物瓦松或晚紅瓦松的全草，《新修本草》描述，瓦松氣微、味酸，具有清熱解毒、止血收斂、利濕消腫以及養(yǎng)心安神等功效，用于吐血、鼻衄、血痢、瘧疾、痔瘡、濕疹、癰毒和疔瘡等癥的治療[1]。相關(guān)文獻報道[2]，瓦松有一定的食用價值，食用口感較好，可作為醬菜的生產(chǎn)原料，并可提取葉蛋白，在食品生產(chǎn)中有深入開發(fā)價值。在藥理作用價值方面，現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)瓦松具有抗腫瘤、抗癌、強心、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等方面均有較好的作用。Yoon Y等人[3]研究表明，日本瓦松粗提物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共10個菌種216株菌均有一定的抑制效果，具有明顯的廣譜抗菌效應(yīng)[3]。

瓦松的主要藥效成分包括多糖、黃酮等物質(zhì)，課題組前期已經(jīng)對瓦松多糖的抑菌效果做了初步研究，發(fā)現(xiàn)瓦松多糖具有一定的抑菌活性，且其抑菌活性高于水提物。但目前國內(nèi)外對瓦松黃酮抑菌的研究較少，為進一步研究瓦松抑菌的主要成分，深入揭示瓦松抑菌機制，課題組提取了瓦松總黃酮，對其抑菌活性開展初步研究。本實驗中選用了部分常見可致食品污染細菌，包括金黃色葡萄球菌ATCC25923標(biāo)準(zhǔn)株及臨床分離MRSA(金黃色葡萄球菌耐甲氧西林株)、大腸埃希菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)株及部分臨床分離株、變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49027、表皮葡萄球菌ATCC12228標(biāo)準(zhǔn)株及其它部分臨床分離菌株、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13883及臨床菌株等共計16株細菌，以不同濃度的瓦松黃酮和水提取物進行了對比實驗，研究瓦松的抑菌效果，以期深入揭示瓦松抑菌機制，擴展瓦松在食品研發(fā)中的應(yīng)用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 瓦松，粉碎后過40目篩，于密封袋中低溫保存，備用；石油醚(批號：2014070，天津市精細化有限公司)；無水乙醇(批號201602253，天津市精細化有限公司)；營養(yǎng)瓊脂(批號：20160508，北京奧博星)；MH肉湯(批號：20140708，北京奧博星)。

1.1.2 儀器 UV9100B型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A上海亞榮生化儀器廠，上海)、KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、離心機(TD5A-W湖南湘儀，湖南湘潭)、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、FA1004N 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、SK-1快速混勻漩渦器(中國深圳)、遠紅外輻射干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)、梅特勒-托利多分析天平(上海先悅機電有限公司)、單通道及12道微量移液器(Dragon)、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)、96孔培養(yǎng)板(新星實驗器材公司，江蘇南通)、普朗DNM-9602酶標(biāo)儀(北京普朗公司)、一次性無菌培養(yǎng)皿(直徑90 mm，新星實驗器材公司，江蘇南通)、蘇凈安泰BSC-1300IIA生物潔凈安全柜(蘇凈集團，江蘇蘇州)和麥?zhǔn)媳葷峁?自制)。

1.1.3 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922表皮葡萄球菌ATCC12228福氏志賀菌ATCC12022、變形桿菌ATCC49027；臨床分離菌株：大腸埃希菌3株、MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)5株，總計12株。上述標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離菌株均由山東中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室提供，各菌株以營養(yǎng)瓊脂進行接種，37 ℃24 h培養(yǎng)后挑取菌苔以生理鹽水配成1×106cfu/mL的對應(yīng)菌液備用。

1.1.4 試劑及其配制

(1)試劑：標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁(10080-200707 中國藥品生物制品檢定所)、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉均為分析純。

(2)試劑的配制：70%乙醇溶液；準(zhǔn)確量取70 mL無水乙醇，加雙蒸水30 mL，混勻；5%亞硝酸鈉溶液；精確稱取2.500 g亞硝酸鈉溶于雙蒸水中，在50 mL容量瓶中定容；10%硝酸鋁溶液；精確稱取5.000 g硝酸鋁溶于雙蒸水中，在50 mL容量瓶中定容；4%氫氧化鈉溶液；精確稱取10.000 g氫氧化鈉溶于雙蒸水中，在250 mL容量瓶中定容。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 用電子天平精密稱取120 ℃恒溫干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶解后定容至刻度，搖勻，即為濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 瓦松總黃酮提取及水提物制備

(1)瓦松總黃酮提取：參照相關(guān)文獻進行瓦松總黃酮的提取[4]。精確稱取瓦松30g，加入600mL 70%濃度的乙醇溶液，先超聲波震蕩處理40min，固液比1∶20，超聲頻率47.6Hz，提取溫度40℃。之后于100℃的溫度下回流2.5h。將總黃酮粗提液抽濾，棄去殘渣，收集濾液。然后將濾液于4℃下8 000r/min離心20min，收集上清液入燒杯中。將所得樣品溶液于旋蒸儀上旋蒸至近干，用盡量少的甲醇將其中樣品洗至蒸發(fā)皿中，減壓濃縮，水浴蒸干，得樣品浸膏77.5mg/g，根據(jù)實驗要求配成所需濃度。

(2)瓦松水提物：稱取瓦松50 g，加入1 000 mL的蒸餾水，文火煎1h，除去藥渣，濃縮水提液至50 mL，即得瓦松水煎液。最終濃度相當(dāng)于原藥1 g/mL。將濃縮液稀釋至0.2 g/mL，以0.22 μm一次性無菌濾器過濾備用。

1.2.3 測定波長的選擇 取標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.0 mL置于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，放置5min，再加10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，放置5min，然后加氫氧化鈉試液4 mL，最后加50%乙醇定容，搖勻，放置15 min。以加0.00 mL標(biāo)準(zhǔn)品為空白對照，進行分光掃描。結(jié)果表明，蘆丁在510 nm處有最大吸收峰。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、1.5、2、2.5、3于10 mL容量瓶，加5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻后靜置5 min；然后加10%的硝酸鋁0.5 mL，搖勻后靜置5 min，最后加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL，并用50 %乙醇稀釋至刻度。然后在波長510 nm處測定吸光度，以蘆丁濃度(Y)對吸光度(X)進行回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=10X+0.018，R2=0.999 2。結(jié)果表明，蘆丁(黃酮類化合物)濃度與對應(yīng)的吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合Lambert-Beer定律。

1.2.5 培養(yǎng)基制備 營養(yǎng)瓊脂,購自北京奧博星生物公司，按說明書配制后121 ℃高壓滅菌20 min，分裝于無菌培養(yǎng)皿制成平板，4 ℃保存?zhèn)溆?。MH(B)肉湯購自北京奧博星生物公司，按說明書配制分裝后于121 ℃高壓滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 細菌培養(yǎng) 制備營養(yǎng)瓊脂平板，分別取上述各菌密集劃線接種于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，以生理鹽水洗脫菌苔制備菌液。

1.2.7 MIC測定 實驗菌液的制備：采用比濁法，將菌液濃度調(diào)整為1×106CFU/mL。抑菌實驗步驟參照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，采用微量稀釋法進行[5]。在96孔板中每孔加入培養(yǎng)基100 μL，然后在第1行中加入100μL藥液，從第1行中吸取100 μL混合液加入第2行，依次類推至第6行，得到2、4、8、16、32、64倍稀釋藥物梯度。第7行每孔加入慶大霉素注射液10 μL為陽性對照，第8行直接加入菌液做為陰性對照。以上藥液和對照加樣完畢后，每孔加入1×106CFU/mL的對應(yīng)菌液10 μL，每個藥物做3次平行試驗，37 ℃培養(yǎng)24 h，以酶標(biāo)儀對培養(yǎng)板在600 nm波長下測定 OD值，結(jié)合細菌生長情況判斷結(jié)果。

1.2.8 MBC測定 從2.8中判定為MIC的孔中，吸取培養(yǎng)物取10μL，以涂布棒無菌操作均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，以37 ℃培養(yǎng)24 h后無明顯生長現(xiàn)象的濃度作為最低殺菌濃度(MBC)[6]。

2 結(jié)果與分析

由表1可見，瓦松總黃酮對各菌均有較好抑制效果。對福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌效果最好，MIC為0.625 mg/mL；對部分臨床分離MRSA、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸埃希菌及其臨床分離株、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株及其臨床分離株的抑菌效果次之，MIC是1.25 mg/mL；對金黃色葡萄球菌、變形桿菌及部分MRSA的抑菌效果較弱，MIC為2.5 mg/mL。瓦松水提物抑菌趨勢與黃酮一致性較差，對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株及1株MRSA的MIC相同，均為12.5 mg/mL，對福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株和3株MRSA的MIC為50 mg/mL，對其余菌株的MIC均為100 mg/mL。從MIC結(jié)果看，瓦松總黃酮的抑菌活性要顯著高于瓦松水提物。

表1 瓦松總黃酮及水提物MIC結(jié)果

表2 瓦松總黃酮及水提物對各菌株的MBC結(jié)果

注：“-”表示無明顯MBC。

由表2可見，瓦松總黃酮及水提物對各菌株均無明顯的MBC，說明其作用機制主要為抑菌而非殺菌。

3 討論

瓦松具有較高食用和藥用價值。食用方面，瓦松新鮮植株肉質(zhì)多汁，適口性較好，除可供人類食用外，在畜牧業(yè)上也有一定應(yīng)用價值[7]；藥用方面，瓦松是民間應(yīng)用較早的中藥之一，具有多種藥理活性[8]。文獻報道，瓦松可用于吐血、鼻衄、血痢、瘧疾、痔瘡、濕疹、癰毒、疔瘡以及肛周膿腫等癥的治療[1]。研究表明，瓦松對金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌的抑菌效果較好；對大腸桿菌、變形桿菌等革蘭氏陰性抑菌效果次之[9]。研究顯示，瓦松的主要成分有黃酮類、有機酸類、甾醇類和強心苷等[10]，其中黃酮類化合物是其重要藥效成分。黃酮類化合物廣泛存在于多種中藥中，有抗微生物、抗氧化、降血糖和抗腫瘤等多種藥理作用，特別是在抗微生物方面，對革蘭陽性菌、陰性菌及部分真菌均有一定的抑菌效果[11]。目前，國外對瓦松屬黃酮的研究主要集中于OrostachysjaponicusA. Berger上，以高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用對其黃酮成分進行了初步分析[12]，發(fā)現(xiàn)其黃酮具有一定的抗氧化作用[13]；在抗腫瘤方面，其黃酮可通過抑制Bcl-2和X-IAP來對MMP進行調(diào)節(jié)，進而誘導(dǎo)人淋巴細胞發(fā)生caspase依賴的細胞凋亡以抑制腫瘤[14]；還可通過滅活A(yù)kt及調(diào)節(jié)緊密連接來抑制前列腺癌LNCaP細胞的侵襲[15]；在其總黃酮中發(fā)現(xiàn)了7種具有較好鈣蛋白酶抑制活性的成分[16]，提示其有一定的抗?jié)冏饔?；此外，該植物甲醇提取物對過氧化氫誘導(dǎo)所致 GT1-1小鼠下丘腦神經(jīng)細胞的凋亡具有一定保護作用[17]。國內(nèi)方面，王亞紅等[18-20]對瓦松屬總黃酮的提取及純化方法做了初步研究；張桂芳等[21]發(fā)現(xiàn)瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠的高脂血癥和臟器損傷有明顯的治療和修復(fù)作用；王翔飛等[22]以黃花瓦松乙醇提取物和石油醚提取物作用于金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)有一定抑菌效果。綜合上述國內(nèi)外研究，瓦松是一種既有食用價值又有藥用價值的植物資源，可作為開發(fā)藥食同源相關(guān)產(chǎn)品的重要原材料。為了深入研究瓦松的藥用及食用價值，在前期研究的基礎(chǔ)上，我們對瓦松總黃酮進行了初步提取，并對抑菌活性進行了檢測。研究中選擇了臨床上常見引起感染的部分細菌，包括標(biāo)準(zhǔn)株及其部分臨床分離株，對瓦松總黃酮的抑菌作用進行了初步研究。通過對比發(fā)現(xiàn)，瓦松總黃酮的抑菌效果要顯著地好于水提物。

金黃色葡萄球菌是目前臨床常見的致病菌之一，該菌容易產(chǎn)生耐藥性，可引起皮膚軟組織感染、敗血癥及導(dǎo)管相關(guān)性感染及食物中毒等多種疾病，是目前危及臨床患者生命的重要致病菌[23]，是食品的主要污染菌之一，近年來其典型耐藥株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)所致感染發(fā)生率呈現(xiàn)逐漸增高趨勢[24]；福氏志賀菌可致細菌性痢疾，在我國，福氏志賀菌導(dǎo)致的病例數(shù)占細菌性痢疾的80%以上[25]，在夏秋季容易通過消化道傳播，亦屬消化道感染細菌之一；變形桿菌多為機會致病菌，但亦可能導(dǎo)致腸道感染以及泌尿系統(tǒng)感染，甚至導(dǎo)致腹瀉等臨床反應(yīng)[26]。大腸埃希菌是臨床上機會性感染的主要病原菌之一，能夠引起泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等感染[27]，其中某些致病菌株可以污染食物，導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎甚至尿毒癥，嚴(yán)重危害食品安全；表皮葡萄球菌是凝固酶陰性葡萄球菌，一般不會導(dǎo)致疾病，但近年所致醫(yī)源性感染不斷增多[28]；肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染最常見的腸桿菌科細菌之一，主要有肺炎、尿路、膽道、傷口、導(dǎo)管及血流等的感染[29]，該菌易產(chǎn)生耐藥性變異，故在臨床工作中應(yīng)合理選擇抗生素。上述各菌皆為臨床常見感染菌，多數(shù)均可污染食物造成感染。本研究結(jié)果顯示，瓦松黃酮對各菌均有一定抑制作用，故其結(jié)果對食品研究更具指導(dǎo)價值。

實驗結(jié)果表明，瓦松總黃酮對其他各標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株均有較好的抑制作用。對福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株有最佳抑菌效果，其MIC為0.625 mg/mL；對2株臨床分離MRSA、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸埃希菌及其臨床分離株、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株及其臨床分離株的抑菌效果次之，MIC是1.25 mg/mL；對金黃色葡萄球菌、變形桿菌及2株臨床分離MRSA的抑菌效果最差，MIC為2.5 mg/mL。瓦松水提物抑菌對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株及1株MRSA的MIC相同，均為12.5 mg/mL；對福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株和另外3株MRSA的MIC為50 mg/mL；對其余菌株的MIC均為100 mg/mL。MIC結(jié)果顯示，瓦松總黃酮有較強的抑菌活性，顯著好于瓦松水提取物。另從MIC的趨勢來看，無論是多糖還是水提物，對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株和表皮葡萄球菌均有較強抑制效果，對其余菌株則有較大差異；所有檢測的菌株均無明顯MBC，提示瓦松水提物和瓦松總黃酮對上述細菌僅有抑制作用，無明顯的殺滅作用。

MIC結(jié)果顯示，瓦松總黃酮對臨床分離的部分MRSA、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌都有較好抑制作用，且顯著好于水提物，也好于課題組前期研究過的瓦松多糖(孫森鳳，范華忠，付葉佩，等.瓦松多糖對部分臨床感染菌的抑菌活性研究，《食品與藥品》雜志已接收)，證明瓦松總黃酮可能是瓦松最主要的抑菌成分。后繼研究中將對瓦松總黃酮進行深入分析，并對其抗炎、鎮(zhèn)痛等活性開展深入研究，進一步明確瓦松的活性物質(zhì)，為拓展瓦松在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供更多依據(jù)?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Extraction and Antibacterial Effect of Total Flavonoids inOrostachyssp.

SUN Sen-feng1，ZHANG Ying-ying2

(1College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2College of Traditional Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Orostachyssp.total flavonoids；bacteriostatic activity；MIC；MBC

山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心課題“中醫(yī)藥抗病毒免疫技術(shù)體系構(gòu)建”(項目編號：XTCX2014B01-04)。

孫森鳳(1995— )，女，本科生，研究方向：從事中藥提取純化及藥理。

張穎穎(1977— )，男，碩士，講師，研究方向：中醫(yī)藥抗病原生物。