毛坤軍，黃平，周慧云，葉錫勇

（江西醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，江西 上饒 334000）

HPLC同時測定祛痰止咳膠囊中3種活性成分含量

毛坤軍，黃平，周慧云，葉錫勇

（江西醫(yī)學高等專科學校藥學系，江西 上饒 334000）

目的：建立祛痰止咳膠囊中阿魏酸、槲皮素、芹菜素3種活性成分的高效液相色譜法（HPLC）含量測定方法。方法：采用phenomonex?-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%的磷酸水溶液（B）為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長為360 nm。結果：阿魏酸、槲皮素、芹菜素在質量濃度分別為0.76～15.2，3.92～76.4，0.59～11.8 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，加樣回收率分別為98.48%，101.43%和99.08%。結論：本試驗所建立的方法準確、可靠、重復性好，可為祛痰止咳膠囊的質量控制提供科學的依據(jù)。

高效液相色譜法；祛痰止咳膠囊；含量測定；質量控制

祛痰止咳膠囊是由《傷寒論》和《金匱要略》中的參夏湯與十棗湯化裁而來，屬國家中藥保護品種[1]。主要由黨參、水半夏、芫花（醋制）、甘遂（醋制）、紫花杜鵑五味中藥組成，具有健脾燥濕、祛痰止咳的功效；臨床上主要用于慢性支氣管炎及支氣管炎合并肺氣腫、肺源性心臟病所引起的痰多咳嗽、喘息等癥[2]。據(jù)報道，芫花和紫花杜鵑作為處方中的君藥和臣藥，具有抗炎和鎮(zhèn)咳祛痰作用，其主要化學成分均為黃酮類成分[3-4]，且藥效學研究表明黃酮類化合物為其鎮(zhèn)咳祛痰的有效成分[5]。目前，祛痰止咳膠囊執(zhí)行標準為《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準》YBZ02962006-2009Z，其含量測定項下以黨參中的阿魏酸為指標成分進行含量測定[6]。鑒于中藥復方成分的多樣性和復雜性，單一成分難以全面評價和控制藥物的內在質量，且作為發(fā)揮藥效的主要成分，黃酮類化合物還未見相關含量測定的研究報道。故本研究以黨參中的阿魏酸、芫花中芹菜素和紫花杜鵑中的槲皮素為指標成分，建立祛痰止咳膠囊中該3種活性成分的HPLC含量測定方法，為進一步提高和完善祛痰止咳膠囊的質量標準提供科學的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀：包括waters e2489檢測器，Empower工作站（美國Waters公司）；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯）；KQ-500DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；純水儀（易普易達科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品：阿魏酸（批號：110773-201012）、芹菜素（批號：100756-201210）、槲皮素（批號：100081-201408）均購自中國藥品生物制品檢定所，純度均≥98%；不同批次祛痰止咳膠囊（購自藥店）；色譜甲醇購自Merck公司；磷酸、分析甲醇為北京化工產品；水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

phenomonex?-C18色 譜 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%的磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，30%～50%A；20～40 min，50%～60%A）；體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長360 nm，進樣量均為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸、槲皮素、芹菜素對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為15.2，76.4，11.8 μg/mL的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取祛痰止咳膠囊10粒，混勻，研細，取約1.0 g，置錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，稱重，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 根據(jù)處方制備缺黨參、紫花杜鵑和芫花的陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取對照品、供試品、陰性對照溶液各10 μL，注入HPLC色譜儀，按“2.1”項下色譜條件分析，見圖1。結果表明3種被測成分能達到完全分離。

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5，5.0，10.0 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。分別精密吸取10 μL注入HPLC分析，以峰面積Y對進樣濃度X進行回歸方程計算，結果見表1。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖

表1 3種被測成分的回歸方程、線性范圍和相關系數(shù)

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積并計算RSD。結果顯示阿魏酸、槲皮素、芹菜素的RSD分別為1.22%，0.87%，1.88%。表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批號（151203）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0，2，4，6，8，12，24 h進樣分析，記錄峰面積并計算RSD。結果顯示阿魏酸、槲皮素、芹菜素的RSD分別為2.04%，1.79%， 2.41%。表明供試品溶液24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批號（151203）樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，記錄峰面積并計算RSD。結果顯示阿魏酸、槲皮素、芹菜素的RSD分別為1.34%，0.89%，2.33%。表明方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 取已知含量（151203）的樣品6份，每份約0.5 g，按1∶1的比例加入對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，計算回收率，結果見表2。

2.3.7 樣品含量測定 取不同批次樣品約1.0 g，每個批次平均3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，以外標法計算含量，結果見表3。

表2 加樣回收率試驗（n＝6）

表3 樣品含量測定結果

3 結語

3.1 提取條件的選擇

采用單因素變量法對提取方法（超聲、回流）；提取溶劑（甲醇、乙醇）；溶劑濃度（60%，80%，100%）；提取時間（30，45，60 min）；料液比（1∶10，1∶25，1∶50）進行考察，結果顯示以25倍量80%甲醇超聲提取30 min所得含量最佳。

3.2 流動相的選擇

由于被測成分均顯一定的酸性，故選擇酸性系統(tǒng)洗脫，本試驗考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液；結果顯示，甲醇分離效果優(yōu)于乙腈，可能是乙腈洗脫效果較強，無法使每個被測成分與相鄰色譜峰完全分離，且出于毒性、價格考慮，在環(huán)保和成本方面甲醇也更優(yōu)于乙腈。故試驗最終選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液進行測定。

3.3 檢測波長的選擇

據(jù)文獻報道，阿魏酸最大紫外吸收波長為320 nm[7]，槲皮素、芹菜素為360 nm[8]。本實驗比較了兩種波長下的吸收峰，結果發(fā)現(xiàn)在320 nm波長下有較多雜質峰，且槲皮素和芹菜素吸收相對較弱，故最終選擇360 nm作為檢測波長。

[1] 郭景仙,賀利軍,林曉蘭.祛痰止咳顆粒臨床使用情況分析[J].醫(yī)藥導報,2007,26(6):678-681.

[2] 陳羽鵬,蘇連彩,丘建芳,等.RH-HPLC法測定祛痰止咳顆粒中槲皮素的含量[J].中醫(yī)藥導報,2006,12(3):56-57.

[3] 李玲芝,宋少江,高品一.芫花的化學成分及藥理作用研究進展[J].沈陽藥科大學學報,2007,24(9):587-592.

[4] 栗建明,侯惠嬋,隆穎.紫花杜鵑藥材質量標準研究[J].今日藥學,2011,21(4):229-231.

[5] 鄭文燕,王曉東,彭維,等.祛痰止咳顆粒指紋圖譜研究[J].中山大學學報:自然科學版,2011,50(3):98-101.

[6] 國家藥典委員會.國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準[S].YBZ02962006-2009Z.

[7] 云學英,吳寧遠,劉曉穎.蒙藥耬斗菜中阿魏酸含量的高效液相色譜法測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2015,26(3):589-590.

[8] 董愛文,朱春艷,卓琦.五爪龍外敷液中芹菜素與槲皮素的HPLC測定[J].天然產物研究與開發(fā),2014,26(2):230-232,272.

本文編輯：魯守琴

Simultaneous Determination of Contents of Three Active Components in Qutanzhike Capsules by HPLC

Mao Kun-jun, Huang Ping, Zhou Hui-yun, Ye Xi-yong
(Department of Pharmacy, Jiangxi Medical College, Jiangxi Shangrao 334000, China)

Objective：To develop a HPLC method for determination of three active constituents, i.e. ferulic acid, quercetin and apigenin in qutanzhike capsules. Methods：Phenomonex?-C18chromatographic column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was adopted serving methanol (A)-0.1%phosphoric acid (B) solution as mobile phase at a fow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30℃. The detection wavelength was 360 nm. Results：The linear ranges of ferulic acid, quercetin and apigenin were 0.76～15.2, 3.92～76.4 and 0.59～1.8 μg/mL, while the average recovery rates were 98.48%, 101.43% and 99.08%, respectively. Conclusion：The developed method was accurate, reliable and reproducible, which provided a scientifc basis for the quality control of qutanzhike capsules.

HPLC; Qutanzhike Capsules; Content Determination; Quality Control

R284.1

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.017

2017 - 03 - 05

毛坤軍，男，碩士，助教。研究方向：藥物質量標準研究。E-mail:737259639@qq.com

葉錫勇，男，學士，教授。研究方向：藥物質量標準研究。E-mail:1962628419@qq.com