黃樹超，郝雪秦，關(guān)艷，鄧琪，韓江雪，肖春玲，劉憶霜

質(zhì)粒介導(dǎo)的摩氏摩根菌KL-225對氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素的耐藥

黃樹超，郝雪秦，關(guān)艷，鄧琪，韓江雪，肖春玲，劉憶霜

目的研究摩氏摩根菌 KL-225 的超廣譜耐藥機(jī)制，為新型抗菌藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

方法提取純化摩氏摩根菌 KL-225 的 pKL2683 和pKL5933 質(zhì)粒，并進(jìn)行序列測定，將測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析找到其可能的耐藥基因，再通過將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入摩氏摩根標(biāo)準(zhǔn)菌株和大腸桿菌，對耐藥基因進(jìn)行驗證。

結(jié)果pKL2683 質(zhì)粒攜帶的qnrD基因?qū)е路Z酮類抗生素對 KL-225 的 MIC 升高；pKL5933 質(zhì)粒攜帶的aac(6′)-Ib-cr4 基因?qū)е?KL-225 對氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素的 MIC 升高。

結(jié)論摩氏摩根菌 KL-225 對氨基糖苷類抗生素的耐藥主要來源于 pKL5933 質(zhì)粒上攜帶的aac(6′)-Ib-cr4 基因；pKL2683 質(zhì)粒攜帶的qnrD基因和 pKL5933 質(zhì)粒攜帶的aac(6′)-Ib-cr4 基因?qū)е?KL-225 對氟喹諾酮類抗生素敏感性降低。

摩氏摩根菌； 質(zhì)粒； 氟喹諾酮類耐藥； 氨基糖苷類耐藥

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(4):317-324

細(xì)菌耐藥問題是 21 世紀(jì)最嚴(yán)重的公共健康問題之一，具有復(fù)雜耐藥機(jī)制的革蘭陰性（G-）菌耐藥問題尤為突出，以表達(dá)新德里金屬 β-內(nèi)酰胺酶-1（NDM-1）[1]為特征的“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)使細(xì)菌耐藥問題成為了全社會關(guān)注的熱點(diǎn)。摩氏摩根菌（M.morganii）KL-225 是從病死鮑魚體內(nèi)分離得到的“超廣譜”、高水平耐藥的 G-菌，其對β-內(nèi)酰胺類（I、II 代固有耐藥）、氨基糖苷類、四環(huán)素類（固有耐藥）、氟喹諾酮類、葉酸抑制劑、氯霉素類、磷霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類（非抗陰性菌藥物）、林可酰胺類（非抗陰性菌藥物）、多肽類等眾多抗菌藥物的耐藥性均有顯著提高，且對青霉素、替卡西林、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、磺胺甲噁唑、甲氧芐啶、氯霉素、磷霉素等抗菌藥物表現(xiàn)出高水平耐藥[2]。菌株M.morganiiKL-225 的耐藥譜已超過了通常意義的多藥耐藥，因此可稱之為“超級”耐藥菌，推測該菌株具有多種耐藥機(jī)制。深入研究和闡明M.morganiiKL-225 的超廣譜耐藥機(jī)制，評價以此菌株作為模式菌株的可行性，對于篩選和研制新型抗菌藥物具有重要意義。

在提取 KL-225 基因組的過程中，發(fā)現(xiàn)KL-225 攜帶了多個質(zhì)粒，推測這些質(zhì)粒的存在可能與其耐藥性有關(guān)。因此，我們率先從提取其攜帶的質(zhì)粒入手，研究 KL-225 的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株M.morganiiKL-225 由福建水產(chǎn)研究所從病死鮑魚體內(nèi)分離和保存，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）保藏，編號 CGMCC3655，保藏日期 2010年 3月10日。M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC25830 購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基 MH 固體培養(yǎng)基：牛肉浸粉 6 g、可溶性淀粉 1.5 g、酸水解酪蛋白胨 17.5 g、瓊脂13 g，pH（7.4 ± 0.2），定容至 1000 ml；MH 肉湯培養(yǎng)基：牛肉浸粉 6 g、可溶性淀粉 1.5 g、酸水解酪蛋白胨 17.5 g、pH（7.4 ± 0.1），定容至 1000 ml；LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化鈉 10 g，pH 7.4，定容至 1000 ml。

1.1.3 試劑 所有抗菌藥物購于中國食品藥品檢定研究院；T 載體（T-Vector PMD19 Simple）試劑盒購于日本 Takara 公司；感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α購于北京全式金生物有限公司；DNA 超螺旋marker 購于日本 Takara 公司和美國 NEB 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購于德國 Qiagen公司。

1.1.4 器材及儀器 超凈工作臺 BCM-1000A 為江蘇蘇凈公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋 mlS-3750 和超低溫冰箱 MDF-U32865 為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；高速微量臺式離心機(jī) Legend Micro 17、紫外分光光度儀 Biomate 3S 和高速冷凍離心機(jī) Legend Mach 1.6R 為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；DNAEngine PCR 儀、BASIC 電泳儀、MicroPulser 電擊轉(zhuǎn)化儀和 XR+凝膠成像儀為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；WD-9403D 型紫外儀和 WD-2101 型電泳系統(tǒng)為北京六一儀器廠產(chǎn)品；DHP-420 型電熱恒溫培養(yǎng)箱為北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；Innova 43 溫控?fù)u床為美國 New Brunswich 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 挑取M.morganiiKL-225 單菌落接種在 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600≈ 0.6）。

1.2.2 質(zhì)粒提取與純化 用質(zhì)粒提取試劑盒提取M.morganiiKL-225 質(zhì)粒，并用膠回收試劑盒純化pKL2683 和 pKL5933。

1.2.3 測序 通過限制性內(nèi)切酶Sau3AI 將質(zhì)粒消化為小片段，并隨機(jī)克隆測序，以測出序列為模板設(shè)計引物，雙方向擴(kuò)增質(zhì)粒，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T 載體中進(jìn)行測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用 BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）和 ORF Finde（rhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.5 測定固體平板上卡那霉素和環(huán)丙沙星對M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株的 MIC 將抗菌藥物配制成濃度為 25.6 mg/ml 的母液，然后將配制好的 20 ml MH 瓊脂培養(yǎng)基在微波爐中加熱至完全溶解，待涼至約 45 ℃（保持液態(tài)）；分別加入 200、100、50、25、12.5、6.25 μl 濃度為 25.6 mg/ml 的抗菌藥物至 20 ml 仍保持液態(tài)的 MH 瓊脂培養(yǎng)基中，充分混勻，制成濃度為 256、128、64、32、16、8 μg/ml的含有抗菌藥物的 MH 瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入培養(yǎng)皿中冷卻凝固，約 20 ml/培養(yǎng)皿。實驗結(jié)果表明，在固體平板上，卡那霉素對M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株的 MIC 為 32 μg/ml；環(huán)丙沙星對M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株的 MIC 為 0.0625 μg/ml。

1.2.6 電擊轉(zhuǎn)化 用M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株制作感受態(tài)細(xì)胞，將 pKL2683 和 pKL5933 電擊轉(zhuǎn)入M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株，轉(zhuǎn)化菌株分別命名為M.m(pKL2683) 和M.m(pKL5933)，分別用含有環(huán)丙沙星（0.125 μg/ml）和卡那霉素（64 μg/ml）的 MH 瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h；觀察細(xì)菌生長情況，有菌落生長的判為陽性轉(zhuǎn)化菌。

1.2.7 陽性轉(zhuǎn)化菌驗證 用質(zhì)粒提取試劑盒提取M.m(pKL2683) 和M.m(pKL5933) 的質(zhì)粒。

1.2.8 在E.coli中驗證耐藥基因 分別從pKL2683 的qnrD基因內(nèi)部和qnrD基因以外的位置擴(kuò)增 pKL2683，保證qnrD基因的斷裂與完整（圖 1 和圖 2），并連接到 T 載體上轉(zhuǎn)化入E.coli，從qnrD基因內(nèi)部克隆的轉(zhuǎn)化菌株命名為E.coli(T-pKL2683*)，從qnrD基因外部克隆的轉(zhuǎn)化菌株命名為E.coli(T-pKL2683)；分別從 pKL5933的aac(6′)-Ib-cr4 基因內(nèi)部和aac(6′)-Ib-cr4 基因以外的位置擴(kuò)增 pKL5933，保證aac(6′)-Ib-cr4 基因的斷裂與完整（圖 3 和圖 4），并連接到 T 載體上轉(zhuǎn)化入E.coli，從aac(6′)-Ib-cr4 基因內(nèi)部克隆的轉(zhuǎn)化菌株命名為E.coli(T-pKL5933*)，從aac(6′)-Ib-cr4 基因外部克隆的轉(zhuǎn)化菌株命名為E.coli(T-pKL5933)。

圖1 從qnrD基因內(nèi)部擴(kuò)增 pKL2683 并連接到 T 載體上Figure 1 pKL2683 was amplified fromqnrDgene and connected to the T-Vector PMD19

圖2 從 qnrD 基因以外的位置擴(kuò)增 pKL2683 并連接到 T 載體上Figure 2 pKL2683 was amplified from the position outside of the qnrD gene and connected to the T-Vector PMD19

圖3 從 aac(6′)-Ib-cr4 基因內(nèi)部擴(kuò)增 pKL5933 并連接到 T 載體上Figure 3 pKL5933 was amplified from aac(6′)-Ib-cr4 gene and connected to the T-Vector PMD19

圖4 從 aac(6′)-Ib-cr4 基因以外的位置擴(kuò)增 pKL5933 并連接到 T 載體上Figure 4 pKL5933 was amplified from the position outside of the aac(6′)-Ib-cr4 gene and connected to the T-Vector PMD19

1.2.9 微孔法測定各種抗菌藥物對各轉(zhuǎn)化菌株和M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株的 MIC 將 96 孔板、U 型槽等在紫外燈下照射 30 min 滅菌；將菌株的培養(yǎng)液用新鮮的 MH 液體培養(yǎng)基稀釋，使其終濃度約為 1.5 × 105cfu/ml；用排式微量移液器將新鮮培養(yǎng)的菌液加入到 96 孔板中，第 1 排 198 μl，2～12 排每孔 100 μl；于第 1 排每孔加入濃度為25.6 mg/ml 的抗菌藥物 2 μl 混勻，使混合液中藥物濃度為 256 μg/ml；從第 1 排吸取 100 μl 液體加入到第 2 排中混勻，使混合液中藥物濃度為128 μg/ml；2～12 排按上述步驟方法，使抗菌藥物濃度依次 2 倍遞減，第 12 排濃度為 0.125 μg/ml（環(huán)丙沙星第 1 排的濃度為 64 μg/ml，第 12 排濃度為 0.3125 μg/ml）；將 96 孔板放置在 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 h；觀察結(jié)果，以細(xì)菌生長完全受抑制的最小濃度記為最低抑菌濃度（MIC 值）。

2 結(jié)果

2.1 M.morganii KL-225 質(zhì)粒電泳圖

由圖 5 可知，M.morganiiKL-225 含有 5 個質(zhì)粒。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

pKL2683 大小為 2683 bp，G+C 含量 41.8%，攜帶氟喹諾酮類耐藥基因qnrD以及 3個功能未知的 ORF 區(qū)（圖 6）；pKL5933 大小 5933 bp，G+C 含量 51.0%，攜帶氨基糖苷 N(6')-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac(6′)-Ib-cr4。pKL5933 與最早報道的鼠傷寒沙門菌 DT104B 攜帶的 pMdT1 質(zhì)粒[3]一致性為 99.85%，與 pMdT1 相比，pKL5933 在aac(6′)-Ib-cr4 基因區(qū)域以外有 9 個堿基變化（圖 7）。

圖5 M.morganiiKL-225 質(zhì)粒電泳圖Figure 5 M.morganiiKL-225 plasmids profile

圖6 pKL2683 質(zhì)粒圖譜Figure 6 pKL2683 plasmid profile

2.3 pKL2683 和 pKL5933 轉(zhuǎn)化菌驗證

如圖 8 可知，質(zhì)粒 DNA 在 marker 指示下DNA 大小在 2～3 kb 之間并接近 3 kb，符合實驗設(shè)計，測序后確定 pKL2683 已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株中。

如圖 9 可知，質(zhì)粒 DNA 在 marker 指示下約為 6 kb，符合實驗設(shè)計，測序后確定 pKL5933已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株中。

2.4 測定多種類型抗菌藥物對各種轉(zhuǎn)化菌和標(biāo)準(zhǔn)菌的 MIC 值

比較各種抗菌藥物的耐藥性差異，結(jié)果如表 1～ 4。在測定細(xì)菌 MIC 時，2 倍之內(nèi)的 MIC 值差異在誤差范圍之內(nèi)。在比較藥物對兩種細(xì)菌的 MIC差異時，4 倍以上的差異判定為耐藥性顯著改變。

與M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星對M.m(pKL2683) 的 MIC 值有顯著提高，說明 pKL2683 導(dǎo)致M.morganiiKL-225 對氟喹諾酮類抗生素的敏感性降低（表 1）。

圖7 pKL5933 質(zhì)粒圖譜Figure 7 pKL5933 plasmid profile

圖8 pKL2683 轉(zhuǎn)化菌驗證電泳圖Figure 8 Validation of pKL2683 transformants

圖9 pKL5933 轉(zhuǎn)化菌驗證電泳圖Figure 9 Validation of pKL5933 transformants

與M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星和氨基糖苷類的卡那霉素與阿米卡星對M.m(pKL5933) 的 MIC 值有顯著提高，說明pKL5933 導(dǎo)致M.morganiiKL-225 對氨基糖苷類抗生素耐藥并對氟喹諾酮類抗生素的敏感性降低（表 2）。

由表 3 可知，與E.coli(T-pKL2683*) 相比，環(huán)丙沙星對E.coli(T-pKL2683) 的 MIC 有顯著提高，而其他類型抗生素的 MIC 沒有變化，說明pKL2683 攜帶的qnrD基因?qū)е翸.morganiiKL-225 對喹諾酮類抗生素的敏感性降低。

表1 各種抗菌藥物對 M.m (pKL2683) 和 M.morganii 標(biāo)準(zhǔn)菌株的 MIC（μg/ml）Table 1 MIC of the M .m (pKL2683) and standard M.morganii bacteria against various antimicrobial agents (μg/ml)

由表 4 可知，與E.coli(T-pKL5933*) 相比，卡那霉素對E.coli(T-pKL5933) 的 MIC提高了32 倍以上，而其他類型抗生素的 MIC 沒有變化，說明 pKL5933 攜帶的aac(6′)-Ib-cr4 基因?qū)е翸.morganiiKL-225 對氨基糖苷類抗生素的耐藥。

3 討論

細(xì)菌對抗生素的耐藥性日益嚴(yán)重，由細(xì)菌耐藥引起的死亡人數(shù)在逐年增加[4]。然而與細(xì)菌耐藥性不斷出現(xiàn)相對的是新型抗菌藥物的匱乏[5-7]。M.morganiiKL-225 是超廣譜耐藥菌，以此作為抗菌藥物篩選的模式菌株，可以排除被其耐藥的已知類型抗菌活性化合物，從而增加了獲得新結(jié)構(gòu)、新機(jī)制的抗 G-耐藥菌藥物的可能性。本研究旨在通過耐藥機(jī)制的研究，闡明 KL-225 作為模式菌株的可行性。

本階段對其攜帶的 2 個質(zhì)粒進(jìn)行了深入研究，明確了這 2 個質(zhì)粒攜帶的耐藥基因，并通過實驗證明了 pKL2683 質(zhì)粒攜帶的qnrD基因和 pKL5933 質(zhì)粒攜帶的aac(6′)-Ib-cr4 基因與M.morganiiKL-225 對于氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素的耐藥密切相關(guān)。值得注意的是，質(zhì)粒pKL2683 與在奇異變形桿菌中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pM510[8]高度同源（在qnrD基因以外的位置僅有1 個堿基差異），一致性為 99.99%；其他腸桿菌科中也存在著與 pKL2683 高度同源的質(zhì)粒，如雷氏普羅威登斯菌攜帶的兩個質(zhì)粒 pDIJ09-518a 和pGHS09-09a[9]，與 pKL2683 的一致性分別為99.85%（在qnrD基因以外的位置有 4 個堿基差異）和 99.78%（在qnrD基因以外的位置有 6 個堿基差異）。這些質(zhì)?？赡軄碓从谕挥H本菌株，是原質(zhì)粒在菌株間穿梭的過程中形成的不同的變體。在其他腸桿菌科中也存在著與 pKL5933 高度同源的質(zhì)粒，如：鼠傷寒沙門菌 DT104B 攜帶的pMdT1[3]質(zhì)粒與 pKL5933 的一致性為 99.85%（在aac(6′)-Ib-cr4 基因以外的位置有 9 個堿基差異），pMdT1 宿主菌株對氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素的耐藥性與 pKL5933 轉(zhuǎn)化菌一致；在陰溝腸桿菌 CY01 中也發(fā)現(xiàn)了與 pKL5933 的一致性為99.93%（在aac(6′)-Ib-cr4 基因內(nèi)部有 4 個堿基差異）的質(zhì)粒 pCY-MdT[10]。說明該質(zhì)粒能在不同的腸桿菌科細(xì)菌中穿梭并傳播耐藥性，除了腸桿菌科細(xì)菌外，此類型的質(zhì)粒能否在其他類型細(xì)菌中復(fù)制和穿梭，有待進(jìn)一步的實驗證明。

表2 各種抗菌藥物對M.m(pKL5933) 和M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株的 MIC（μg/ml）Table 2 MIC of theM.m(pKL5933) and standardM.morganiibacteria against various antimicrobial agents (μg/ml)

表3 各種抗菌藥物對E.coli(T-pKL2683*) 和E.coli(T-pKL2683) 的 MIC（μg/ml）Table 3 MIC of theE.coli(T-pKL2683*) andE.coli(T-pKL2683) against various antimicrobial agents (μg/ml)

表4 各種抗菌藥物對E.coli(T-pKL5933*) 和E.coli(T-pKL5933) 的 MIC（μg/ml）Table 4 MIC of theE.coli(T-pKL5933*) andE.coli(T-pKL5933) against various antimicrobial agents (μg/ml)

本研究僅僅闡明了 2 個質(zhì)粒介導(dǎo)了M.morganiiKL-225 對氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素的耐藥，而M.morganiiKL-225 具有超廣譜的耐藥性，表明了在M.morganiiKL-225 基因組和其余質(zhì)粒中可能還存在著其他的耐藥機(jī)制。在后續(xù)研究中通過對M.morganiiKL-225 和M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC25830 基因組序列進(jìn)行比對，對差異序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，推測可能耐藥相關(guān)基因并在E.coli和M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株中克隆表達(dá)來驗證其耐藥相關(guān)性。對于M.morganiiKL-225其余質(zhì)粒的研究，較小質(zhì)粒的測序方法同 pKL2683和 pKL5933 質(zhì)粒，較大的質(zhì)粒需要對其進(jìn)行高通量測序，將測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析找到其可能的耐藥相關(guān)基因，通過本研究類似方法來驗證其耐藥相關(guān)性。通過這些研究對M.morganiiKL-225的耐藥機(jī)制展開深入研究，闡明其復(fù)雜的耐藥機(jī)制。

另一方面，以M.morganiiKL-225 為模式菌株進(jìn)行篩選，可提高新結(jié)構(gòu)、新機(jī)制抗菌活性化合物的篩選效率。因此在對M.morganiiKL-225 的耐藥機(jī)制加以闡明之后，以M.morganiiKL-225 為模式菌株構(gòu)建抗多藥耐藥 G-菌藥物篩選模型，篩選出對M.morganiiKL-225 具有良好抑菌活性，且不被M.morganiiKL-225 耐藥（對M.morganiiKL-225與M.morganii標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC25830 活性無顯著差異）的化合物，通過成藥性研究，可能從中獲得具有良好成藥前景的新型抗多藥耐藥 G-菌候選藥物；同時，利用誘導(dǎo)耐藥突變、蛋白質(zhì)組芯片等方法對這些候選藥物進(jìn)行作用靶標(biāo)的研究，將獲得全新的抗 G-菌藥物靶標(biāo)，為具有全新機(jī)制的抗G-菌藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(4):317-324

第十屆中國生物產(chǎn)業(yè)大會在廣州開幕

7月 3日，第十屆中國生物產(chǎn)業(yè)大會在廣州開幕，此次大會主題為“促進(jìn)生物產(chǎn)業(yè)新發(fā)展，培育生物經(jīng)濟(jì)新動能”，來自全球百位頂尖專家在高層論壇和 16 個專業(yè)分論壇上針對各自細(xì)分領(lǐng)域進(jìn)行專業(yè)探討。中央政治局委員、廣東省委書記胡春華同志出席了開幕式。

其中，由我會主辦、多贏時代轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院協(xié)辦的“再生醫(yī)學(xué)與健康產(chǎn)業(yè)高峰論壇”在白云國際會議中心 4 號樓一樓清遠(yuǎn)廳舉辦。本次論壇邀請到日本再生醫(yī)學(xué)論壇（FIRM 協(xié)會）和國內(nèi)有關(guān)專家就“再生醫(yī)學(xué)與健康產(chǎn)業(yè)”等專業(yè)問題進(jìn)行了深入交流。協(xié)會李少麗副理事長和吳朝暉秘書長出席會議。

Plasmids-mediated aminoglycosides resistance and fluoroquinolones resistance in Morganella morganii KL-225

HUANG Shu-chao, HAO Xue-qin, GUAN Yan, DENG Qi, HAN Jiang-xue, XIAO Chun-ling, LIU Yi-shuang

ObjectiveTo study the mechanisms of broad-spectrum resistance inM.morganiiKL-225 and lay foundation for the development of novel antibacterial drugs.

MethodspKL2683 and pKL5933 inM.morganiiKL-225 were extracted and purified, then sequenced.Bioinformatics analysis was performed on the sequencing results to find out possible resistance-related genes.The plasmids were transferred into theM.morganiistandard strains and resistance genes were expressed inEscherichia colifor verification.

ResultsqnrDgene carried by pKL2683 increased the fluoroquinolones MICs for KL-225; The pKL5933 plasmid carriesaac(6')-Ib-cr4gene, which increased the aminoglycosides and fluoroquinolones MICs for KL-225.

ConclusionM.morganiiKL-225 is resistant to aminoglycosides mainly because of the pKL5933 plasmid which carries theaac(6′)-Ib-cr4 gene.Theaac(6′)-Ib-cr4 gene carried by pKL5933 plasmid andqnrDgene carried by pKL2683 plasmid decreased the susceptibility to fluoroquinolones in KL-225.In order to completely clarify the mechanisms of broad-spectrum resistance inM.morganiiKL-225, it is necessary to study the genome and other plasmids.

Morganella morganii; Plasmid; Resistance to fluoroquinolones; Resistance to aminoglycosides

LIU Yi-shuang, Email: yishuang@gmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.005

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）青年科學(xué)家專題（2015AA020911）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81102353）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室

劉憶霜，Email：yishuang@gmail.com

2017-04-27

Author Affiliation:Department of National Laboratory for Screening New Microbial Drugs, The Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China