舒妮燕 于合國(guó) 王玉柱 李衛(wèi)華 施惠娟 刁 華△

(1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生殖生物學(xué)研究室 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院,上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所,國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

色瑞替尼對(duì)精子制動(dòng)作用和質(zhì)膜損傷的體外研究

舒妮燕1,2于合國(guó)2王玉柱2李衛(wèi)華2施惠娟2刁 華2△

(1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生殖生物學(xué)研究室 上海 200032;2復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院,上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所,國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

目的 研究前期篩選到的精子功能調(diào)節(jié)候選化合物色瑞替尼的體外精子制動(dòng)作用和機(jī)制。方法 計(jì)算機(jī)輔助精液分析(computer assistant sperm analysis,CASA)系統(tǒng)測(cè)定色瑞替尼對(duì)人和小鼠高活力精子20 s內(nèi)的制動(dòng)效果;低滲膨脹(hypo-osmotic swelling,HOS)實(shí)驗(yàn)、SYBR-14/PI染色探究精子質(zhì)膜的完整性;用電鏡觀察色瑞替尼處理后精子質(zhì)膜的變化;用色瑞替尼處理VK2/E6E7、End1/E6E7、Ect1/E6E7細(xì)胞,CCK-8及熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果 色瑞替尼對(duì)于(5～10)×106/mL人精子的20 s瞬間殺精最小有效濃度(minimal effective concentration,MEC)為(74.87±31.46) μmol/L,而相同條件下測(cè)到的殺精藥物壬苯醇醚(nonoxynol-9,N-9)的MEC為(219.75±20.89) μmol/L。CASA系統(tǒng)分析表明,色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)作用有時(shí)間-濃度依賴關(guān)系。HOS實(shí)驗(yàn)及SYBR-14/PI染色法驗(yàn)證色瑞替尼對(duì)精子質(zhì)膜有一定的損傷,并可致精子死亡。電鏡顯示色瑞替尼處理后的精子質(zhì)膜破裂,頭尾分離較多。色瑞替尼對(duì)上皮細(xì)胞有一定損傷。結(jié)論 色瑞替尼對(duì)精子有快速的制動(dòng)作用,具有潛在的避孕藥效。

色瑞替尼; 精子制動(dòng); 避孕潛能; 小鼠

精子功能調(diào)控已成為不孕不育和安全避孕相關(guān)的重要生殖健康課題。隨著社會(huì)工業(yè)化程度的提高和環(huán)境污染的加重,不孕不育率顯著增加。我國(guó)不孕不育率已高達(dá)15%～20%,其中與男性因素相關(guān)的約占50%。男性不育的主要原因是精子數(shù)量的減少和質(zhì)量的下降。另一方面,如何安全避孕也是全球性的問題。目前,主要是女性負(fù)擔(dān)了避孕的重任,而男性僅可采用性交中斷(體外排精)、避孕套(陰莖套)和輸精管絕育術(shù)。調(diào)查顯示,男性可以也愿意承擔(dān)更多的責(zé)任。不論男性還是女性,對(duì)男性避孕藥的態(tài)度都相當(dāng)積極[1]。當(dāng)前迫切需要發(fā)展安全、有效、可逆的針對(duì)精子的避孕藥物。目前男性節(jié)育藥物包括激素類和非激素類,男性避孕措施中激素避孕方法和新的外科節(jié)育方法最接近臨床應(yīng)用[2]。但是,非激素類的男性避孕方法因特異針對(duì)睪丸、附睪或者精子特異的靶標(biāo),可能具有較少的不良反應(yīng)和較好的可逆性,因而成為研究開發(fā)的趨勢(shì)。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)翻譯后修飾如乙酰化、磷酸化等對(duì)精子功能調(diào)控有重要作用,在此基礎(chǔ)上針對(duì)性地從化合物庫(kù)中篩選出一系列乙?；⒘姿峄嚓P(guān)的抑制劑且具有顯著的調(diào)控精子功能活性的非激素類作為候選化合物。其中色瑞替尼(ceritinib)對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)抑制效應(yīng)非常明顯,表現(xiàn)為20 s內(nèi)使所有精子失去運(yùn)動(dòng)活性所需的藥物最小濃度(minmal effective concentration,MEC)比經(jīng)典的殺精藥物壬苯醇醚(nonoxynol-9,N-9)還要低3倍左右。色瑞替尼是治療間變性淋巴瘤激酶-陽(yáng)性轉(zhuǎn)移且對(duì)克唑替尼進(jìn)展或不能耐受的非小細(xì)胞肺癌患者的二線藥物,2014年獲美國(guó)FDA加速審批程序批準(zhǔn)上市。FDA的研究報(bào)告了色瑞替尼導(dǎo)致孕鼠少量胚胎發(fā)育異常,但推薦劑量下用猴、大鼠進(jìn)行的毒理學(xué)研究未發(fā)現(xiàn)其對(duì)雄性和雌性生殖器官有不良效應(yīng)[3-4]。我們對(duì)色瑞替尼體外精子制動(dòng)作用及其機(jī)制進(jìn)行了探索,并參照N-9的殺精效果進(jìn)行了比較,初步探究了色瑞替尼作為外用殺精劑的潛力,同時(shí)提示育齡男性色瑞替尼用藥潛在的精子毒性風(fēng)險(xiǎn)。

材 料 和 方 法

主要試劑及儀器 色瑞替尼(美國(guó)Selleck公司)溶解在DMSO (美國(guó)Sigma公司)中制備成10 mmol/L儲(chǔ)液;N-9(西安瑞聯(lián)生物技術(shù)有限公司)溶解在超純水中制備成40 mg/mL儲(chǔ)液;精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液(以下簡(jiǎn)稱為BWW培養(yǎng)液)按WHO第5版配方配制,所需試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;LIVE/DEAD精子存活測(cè)定試劑盒(L-7011,美國(guó)Invitrogen公司);細(xì)胞增殖分析試劑盒(CCK-8,上海同仁藥業(yè)股份有限公司);角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);計(jì)算機(jī)輔助精液分析(computer assistant spermanalysis,CASA,HTM-TOX IVOS版本12.3A)系統(tǒng)為瑞士漢密爾頓有限公司產(chǎn)品;掃描電子顯微鏡(Quanta 250 FEG,荷蘭FEI公司);高級(jí)濺射鍍膜儀(Leica EM SCD050,上海電子光學(xué)技術(shù)研究所);透射電子顯微鏡CM 120 (荷蘭Philips公司)。流式細(xì)胞儀(Accuri C6,美國(guó)BD公司);酶標(biāo)儀(ELx800,美國(guó)BioTek公司);倒置相差顯微鏡(DMi1,德國(guó)Leica公司);激光共聚焦顯微鏡(A1R,日本Nikon公司)。

細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)基 VK2/E6E7陰道上皮細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);End1/E6E7宮頸細(xì)胞系、Ect1/E6E7宮頸陰道細(xì)胞系均獲贈(zèng)于南京大學(xué)。所有細(xì)胞株均采用角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng),37 ℃、5% CO2條件下使細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)至8～10周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

精子制動(dòng)實(shí)驗(yàn)

精液標(biāo)本的采集 選取2016年3～9月就診于上海計(jì)生所醫(yī)院門診部的男性患者,年齡25～35歲,平均年齡(30.0±5.0)歲,禁欲3～8天,手淫法收集精液,選取的精液樣本應(yīng)在0.5 h內(nèi)液化,精子密度≥15×106/mL,精子活率>70%,pH值為7.2～8.0,精液量>2 mL,(a+b)級(jí)精子≥50%或a級(jí)精子≥25%,白細(xì)胞<1×106/mL,血清和精漿抗精子抗體均為陰性,符合《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn),精液標(biāo)本捐獻(xiàn)者知情同意,標(biāo)本在完成實(shí)驗(yàn)后,全部煮沸,高溫殺滅。

高活力精子的獲取 采用精子上游法獲得高活力精子[5]:將500 μL液化的精液標(biāo)本加在1 000 μL BWW培養(yǎng)液下方,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45～60 min。取上層600 μL培養(yǎng)液,可獲高活力精子,用精子培養(yǎng)液調(diào)整精子濃度至(10～20)×106/mL。

小鼠的高活力精子獲取:將小鼠以頸椎脫臼法處死,取出小鼠附睪尾部并剪開一道小口,以鑷子擠出里面的精液放入37 ℃預(yù)熱的1 mL BWW培養(yǎng)液中,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)15 min,取上層清液即得高活力小鼠精子。

瞬間殺精效果測(cè)定 瞬間殺精效果,即20 s能夠100%制動(dòng)精子的最低藥物濃度(minimal effective concentration,MEC)。

實(shí)驗(yàn)共設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(N-9)和色瑞替尼組。室溫條件下在96孔板內(nèi)用BWW培養(yǎng)液逐孔倍比稀釋藥物,每孔為50 μL。 96孔板放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育30 min。逐孔加入50 μL精子懸浮液,勻速吹打5次混勻,鏡下(×100)觀察在20 s內(nèi)精子是否全部失活。最終測(cè)出MEC。對(duì)小鼠精子MEC的測(cè)定方法同上。

CASA系統(tǒng)分析化合物制動(dòng)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù) (10～20)×106/mL高活力精子懸浮液分別置入各EP管中,與500 μL各濃度的藥物分別充分混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱0.5～3 h后用CASA分析(每樣品記錄5個(gè)視野)。繪制藥物對(duì)精子制動(dòng)效果的時(shí)間-劑量曲線。

精子復(fù)活試驗(yàn) 選擇經(jīng)MEC色瑞替尼處理后的精子樣本,以BWW培養(yǎng)液300×g離心5 min,洗滌2次去除色瑞替尼,加入0.5 mL BWW培養(yǎng)液,并在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)30～60 min,顯微鏡下觀察10個(gè)視野,記錄是否有活動(dòng)精子。

低滲膨脹實(shí)驗(yàn) 300×g離心5 min去除精子懸液中的藥液,200 μL BWW培養(yǎng)液重懸后取100 μL加入1 mL低滲膨脹(hypo-osmotic swelling,HOS)溶液(75 mmol/L果糖,20 mmol/L檸檬酸鈉)混合,置于37 ℃溫箱中30 min。將混合液滴加在載玻片上,蓋玻片封蓋,倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)顯示特征尾部卷曲或腫脹的精子數(shù)目。

精子尾部腫脹率=尾部腫脹數(shù)/精子計(jì)數(shù)的總數(shù)×100%。對(duì)照組中有60%以上的精子出現(xiàn)尾部腫脹,則認(rèn)為HOS實(shí)驗(yàn)正常。

流式細(xì)胞儀法檢測(cè)精子存活率 采用SYBR-14/PI雙染法觀察精子存活情況及質(zhì)膜完整性。取5 μL SYBR-14加入1 mL精子懸浮液中(終濃度為100 nmol/L),混勻后37 ℃、5% CO2避光孵育5～10 min。BWW培養(yǎng)液300×g離心5 min,洗滌2次后重懸沉淀,加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)(終濃度為12 μmol/L),37 ℃、5% CO2避光孵育5～10 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)SYBR-14/PI染色后的各組精子,精子計(jì)數(shù)>10 000,計(jì)SYBR-14+/PI-的精子數(shù)為質(zhì)膜完整精子數(shù)。

電子顯微鏡觀察精子質(zhì)膜的損傷 取精子懸液制作涂片,晾干后在2.5%的戊二醛中固定2 h,PBS 300×g離心5 min,洗3次,用1%鋨酸固定,PBS 300×g離心5 min,洗3次,不同濃度酒精梯度脫水,離子濺射儀鍍金后掃描電子顯微鏡觀察并記錄。300×g離心5 min,沉淀精子,固定脫水,加包埋液浸透固化,切片,染色,透射電子顯微鏡下觀察拍片。

色瑞替尼對(duì)陰道上皮細(xì)胞的影響

CCK-8測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VK2/E6E7、End1/E6E7、Ect1/E6E7細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔接種約5 000個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液,PBS洗滌1次,將各培養(yǎng)孔分為對(duì)照組和藥物處理組。在藥物處理組中加入200 μL預(yù)先配置好的各濃度梯度的色瑞替尼或N-9溶液,對(duì)照孔加入200 μL培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24 h、48 h后去除培養(yǎng)液,加入不含血清的培養(yǎng)液100 μL和10 μL的CCK-8試劑。靜置30 min后,37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)2 h,采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(D)值,測(cè)得細(xì)胞抑制率,計(jì)算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。細(xì)胞抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)孔D值-空白孔D值)/(對(duì)照孔D值-空白孔D值)×100%。

藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 將VK2/E6E7、Ect1/E6E7和End1/E6E7細(xì)胞分別接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞長(zhǎng)至90%,更換培養(yǎng)液,分別用含和不含藥物的角質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)、PI、Hoechst 33342溶液分別進(jìn)行細(xì)胞染色(終濃度分別為2 μmol/L、4 μmol/L和0.5 μg/mL)。用激光共聚焦顯微鏡對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行觀察。

結(jié) 果

色瑞替尼對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的抑制

色瑞替尼20s內(nèi)100%制動(dòng)精子的MEC精子運(yùn)動(dòng)能力是精子最易觀察的活性指標(biāo),在觀察到色瑞替尼的體外精子運(yùn)動(dòng)抑制活性的基礎(chǔ)上,我們參考Sander-Cramer方法[6]進(jìn)行了定量的觀察。色瑞替尼20s內(nèi)制動(dòng)人和小鼠精子的MEC分別為(74.87±31.46)μmol/L(n=4)和(72.00±9.70)μmol/L(n=5),具有相似的快速制動(dòng)作用(圖1)。為了評(píng)估色瑞替尼對(duì)精子運(yùn)動(dòng)抑制的相對(duì)毒性,我們采用經(jīng)典的體外殺精劑N-9作為對(duì)照進(jìn)行比較研究。相同條件下實(shí)驗(yàn)測(cè)得N-9 20s內(nèi)制動(dòng)人和小鼠精子的MEC分別為(219.75±20.89)μmol/L和(310.80±36.42)μmol/L。數(shù)據(jù)表明色瑞替尼的MEC數(shù)值顯著低于N-9,提示色瑞替尼具有很強(qiáng)的制動(dòng)精子運(yùn)動(dòng)的活性。

色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)效果 為了探究色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)作用是否有時(shí)間-濃度的依賴關(guān)系,我們利用CASA系統(tǒng)持續(xù)測(cè)定加藥處理后精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)。

non-paired student’sttest.

圖1 色瑞替尼20 s內(nèi)使精子制動(dòng)的最小有效濃度

Fig 1 MEC of ceritinib required to cause permostasis spermatozoa within 20 s

色瑞替尼對(duì)人和小鼠精子運(yùn)動(dòng)的抑制作用表現(xiàn)為隨著濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng),精子活力(a+b+c級(jí),a+b級(jí))逐漸降低直至無(wú)活動(dòng)精子(圖2)。隨著色瑞替尼濃度的升高,精子活力(a+b+c級(jí),a+b級(jí))降低的越快。當(dāng)色瑞替尼濃度恒定時(shí),隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),活動(dòng)精子數(shù)量逐漸下降(圖2A、2A′)?？芍鹛婺釋?duì)人類及小鼠精子運(yùn)動(dòng)的抑制作用隨著濃度增加而增強(qiáng),且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng),具有明顯的劑量-時(shí)間依賴關(guān)系。由圖2可見,30 min處理使人和小鼠精子100%制動(dòng)所需的色瑞替尼濃度分別為5和25 μmol/L。而相同條件下,使人和小鼠精子100%制動(dòng)所需的N-9濃度為200 μmol/L,這表明色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)活性大于殺精劑N-9。色瑞替尼在2 h內(nèi)100%制動(dòng)人精子的濃度低至5 μmol/L。

精子復(fù)活試驗(yàn) 選取20 s MEC色瑞替尼處理的100%精子制動(dòng)的樣本,洗去色瑞替尼并加入0.5 mL BWW培養(yǎng)液,孵育30～60 min,顯微鏡下未觀察到活動(dòng)精子,即色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)作用是不可逆的。

HOS實(shí)驗(yàn) 為了探究色瑞替尼抑制精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制,先以HOS實(shí)驗(yàn)來(lái)確定色瑞替尼作用于精子后精子的質(zhì)膜是否完整。

空白對(duì)照組中精子尾部84%發(fā)生腫脹蜷曲,證明精液標(biāo)本及HOS低滲液正常。用N-9處理精子20 s后HOS實(shí)驗(yàn)可見精子尾部幾乎不發(fā)生腫脹(0.62%),提示膜已通透。色瑞替尼組的腫脹發(fā)生率低至4.67% (圖3),提示色瑞替尼MEC在20 s內(nèi)能破壞精子質(zhì)膜。

The impact of ceritinib (A) and N-9 (B) on human sperm motility and progressive motility (A’ and B’),respectively.The impact of ceritinib (C) and N-9 (D) on mouse sperm motility and progressive motility (C’ and D’),respectively.Motility (%):The percentage of motile sperm [(a+b+c)%];Progressive (%):The percentage of forward spermatozoa [(a+b)%].CN:Blank control.

圖2 低于MEC濃度的色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)效果與時(shí)間-濃度關(guān)系曲線

Fig 2 The time-dose related spermostatic effects of ceritinib below MEC

A:Untreated human sperm (control);B:N-9-treated (MEC with in 20 s) human sperm; C:Ceritinib-treated (MEC with in 20 s) human sperm;D:The percentage of HOS-positive sperm after treatments.CN:Blank control.(1)P<0.01,(2)P<0.05 (Chi-square test).

圖3 色瑞替尼及N-9對(duì)精子質(zhì)膜的影響(HOS實(shí)驗(yàn))

Fig 3 The effects of ceritinib and N-9 on the sperm plasma membrane integrity (HOS assay)

流式細(xì)胞儀測(cè)定精子存活率 綠色熒光標(biāo)記質(zhì)膜完整的活精子,紅色熒光標(biāo)記質(zhì)膜遭破壞的死亡精子,發(fā)出兩種熒光的雙陽(yáng)性精子為正處于瀕死的過(guò)渡狀態(tài)?？瞻讓?duì)照組活精子比率達(dá)到84% (圖4A),陽(yáng)性對(duì)照N-9 處理精子的死亡率達(dá)96.1% (圖4B)。以50 μmol/L色瑞替尼處理精子20 s,精子膜通透,死亡率達(dá)93.9% (圖4C),5 μmol/L色瑞替尼處理精子30 min的死亡率達(dá)96.2% (圖4D)。表明色瑞替尼制動(dòng)的精子質(zhì)膜已經(jīng)遭到破壞,并致細(xì)胞死亡。提示與N-9類似,色瑞替尼可能是通過(guò)破壞精子質(zhì)膜而對(duì)精子產(chǎn)生制動(dòng)效應(yīng)。

掃描及透射電子顯微鏡觀察精子質(zhì)膜改變 掃描及透射電子顯微鏡觀察空白對(duì)照組精子頭部呈橢圓形,質(zhì)膜表面光滑(圖5A),質(zhì)膜完整(圖5C)。而用20 s MEC的色瑞替尼處理精子頭部與尾部結(jié)合處斷裂較多,頭部質(zhì)膜有溶解性改變,尾部有起泡樣改變(圖5B);透射電鏡下可見頂體輕微損傷,頭頸部有斷裂,頭部質(zhì)膜明顯破裂,線粒體部分有明顯損傷(圖5D)。而N-9處理后精子質(zhì)膜破壞嚴(yán)重,大部分精子頂體膜呈溶解性改變[7]。

色瑞替尼對(duì)上皮細(xì)胞的影響 色瑞替尼對(duì)上皮細(xì)胞具有細(xì)胞增殖抑制作用(圖6)。色瑞替尼和N-9對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞IC50值分別為(2.507±0.159) μmol/L和(2.552±0.145) μmol/L,對(duì)End1/E6E7細(xì)胞IC50值分別為(1.758±0.215) μmol/L和(2.343±0.243) μmol/L,對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞IC50值分別為(3.705±0.351) μmol/L和(2.401±0.199) μmol/L,兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明色瑞替尼和N-9對(duì)上皮細(xì)胞增殖抑制效果類似。

A:Control,untreated human sperm;B:Human sperm treated with 162 μmol/L N-9 for 20 s;C:Human sperm treated with 50 μmol/L ceritinib for 20 s;D:Human sperm treated with 5 μmol/L ceritinib for 30 min.

圖4 SYBR-14/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定色瑞替尼對(duì)精子質(zhì)膜的影響

Fig 4 Flow cytometry analysis of the impact of ceritinib on sperm plasma membrane integrity after SYBR-14/PI staining

A and C:Untreated normal spermatozoa;B and D:Spermatozoa treated with 50 μmol/L ceritinib for 20 s.The red arrow indicates the damage of plasma membrane in comparison to normal spermatozoa.

圖5 掃描電鏡和透射電鏡下觀察色瑞替尼處理后人精子質(zhì)膜損傷

Fig 5 Sperm membrane damages caused by ceritinib were observed with scanning electron microscopy and transmission electron microscopy

色瑞替尼和N-9分別處理VK2/E6E7細(xì)胞6 h后,以鈣綠黃素-AM/PI/Hoechst 33342三重染色后放在激光共聚焦顯微鏡下觀察,鈣綠黃素-AM染活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,PI染死細(xì)胞發(fā)出紅色熒光;Hoechst 33342染細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光?？瞻讓?duì)照組中VK2/E6E7綠色熒光較多,細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞生長(zhǎng)良好;N-9處理后幾乎沒有綠色熒光,細(xì)胞大部分破裂死亡,細(xì)胞形態(tài)遭到破壞;色瑞替尼處理6 h后,有的出現(xiàn)綠色熒光,但形態(tài)不完整(圖7)?？梢娚鹛婺釋?duì)上皮細(xì)胞膜有一定的損傷。

The average cell inhibition (%) of control is viewed as 0%.

圖6 色瑞替尼和N-9對(duì)VK2/E6E7 (A、A’)、End1/E6E7 (B、B’)、Ect1/E6E7 (C、C’)細(xì)胞抑制率的比較

Fig 6 Comparison of the inhibitory effects of ceritinib and N-9 on VK2/E6E7 cells (A,A’),End1/E6E7 cells (B,B’) and Ect1/E6E7 cells (C,C’)

After treatments for 6 h,VK2/E6E7 cells were stained with Calcein-AM/PI/Hoechst33342.A:Untreated blank control;B:Treated with 100 μmol/L N-9;C:Treated with 100 μmol/L ceritinib.

圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察化合物處理后的VK2/E6E7細(xì)胞存活情況及形態(tài)

Fig 7 Survival rates and cell morphology of VK2/E6E7 was observed under laser confocal microscope

討 論

我們首次報(bào)道色瑞替尼對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)具有快速制動(dòng)能力。色瑞替尼20 s內(nèi)100%制動(dòng)人精子的MEC為(74.87±31.46) μmol/L,與經(jīng)典殺精劑N-9的MEC [(219.75±20.89 μmol/L)]比較,色瑞替尼具有更好的殺精制動(dòng)效果。此外,色瑞替尼對(duì)人類和小鼠的精子均具有類似的精子制動(dòng)作用,提示可能具有共同的作用機(jī)制。我們初步揭示了色瑞替尼體外制動(dòng)精子運(yùn)動(dòng)活性的機(jī)制主要是通過(guò)破壞精子膜的完整性。N-9作用于精子的機(jī)制是由于表面活性劑的親脂性與精子頂體膜和中段的脂質(zhì)相互作用,裂解精子膜,導(dǎo)致精子的制動(dòng)和死亡[8]。觀測(cè)色瑞替尼處理組精子的存活率及質(zhì)膜完整性實(shí)驗(yàn)表明,色瑞替尼能破壞精子質(zhì)膜的完整性,導(dǎo)致絕大部分精子死亡。電鏡觀測(cè)顯示色瑞替尼作用下精子頂體膜發(fā)生脫落,精子頸部細(xì)胞膜破裂,精子頭尾分離。證明了色瑞替尼對(duì)精子質(zhì)膜有很強(qiáng)的破壞作用。精子復(fù)活實(shí)驗(yàn)也證明色瑞替尼對(duì)精子造成了不可逆的功能損傷。但是其通過(guò)何種方式對(duì)質(zhì)膜造成損傷還有待研究。

色瑞替尼較N-9具有更優(yōu)良的殺精效果,提示其還有作為外用殺精劑的潛能。通過(guò)定量比較,我們證明色瑞替尼的精子制動(dòng)作用比經(jīng)典的體外殺精劑N-9強(qiáng),且在低劑量如5 μmol/L以下,仍有時(shí)間和劑量依賴的效應(yīng)。N-9是目前國(guó)內(nèi)外最常用的外用陰道殺精劑,能非特異性的破壞精子細(xì)胞膜而起殺精作用。雖然N-9有較大的刺激性及感染HIV風(fēng)險(xiǎn)增加等缺陷[9-10],但目前還沒有其他殺精劑可以取代N-9。所以在研究降低N-9刺激性、提高安全性的劑型[如安芳欣(壬苯醇醚緩釋凝膠劑)[11]]之外,還有必要開發(fā)具有優(yōu)良?xì)⒕Ч男禄衔铩Ｉ鹛婺峋哂幸欢ǖ臐摿?但還需進(jìn)行成藥性的更詳細(xì)評(píng)估。將色瑞替尼與N-9比較時(shí),N-9的20 s制動(dòng)濃度與文獻(xiàn)[12]所述0.20～0.25 mg/mL (約為324.24～405.30 μmol/L)有微小差距,主要原因可能有:N-9藥品來(lái)源不同;測(cè)定精子活力的方法雖然都使用Sander-Cramer方法,但溶液與精液比例不完全一致。

色瑞替尼在治療非小細(xì)胞肺癌時(shí)應(yīng)答性非常好,解決了對(duì)克唑替尼耐受的問題[13],根據(jù)美國(guó)FDA的研究報(bào)告,色瑞替尼的生殖毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)雌性懷孕動(dòng)物影響胚胎發(fā)育,造成骨異常、臟器異常、鎖骨下動(dòng)脈異常等[3-4]。建議女性在完成色瑞替尼用藥治療后至少兩周進(jìn)行有效避孕[3],但沒有對(duì)育齡男性用藥進(jìn)行足夠的生殖風(fēng)險(xiǎn)提示。我們?cè)隗w外觀察到色瑞替尼有明顯的精子毒性,這是此前未見報(bào)道的,提示育齡男性患者精子接觸色瑞替尼可能具有精子毒性的潛在風(fēng)險(xiǎn)。由于色瑞替尼是口服藥物,在體內(nèi)可能發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,且體內(nèi)有血睪屏障的存在,其是否會(huì)對(duì)睪丸、附睪中不同發(fā)育階段的精子具有毒性,還需進(jìn)一步研究。

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The spermostatic and plasma membrane injury effects of ceritinibinvitro

SHU Ni-yan1,2, YU He-guo2, WANG Yu-zhu2, LI Wei-hua2, SHI Hui-juan2, DIAO Hua2△

(1DepartmentofReproductiveBiology,ShanghaiMedicalCollege,Shanghai200032,China;2KeyLabofReproductionRegulationofNPFPC,SIPPR,IRD,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To explore theinvitrospermostatic effects and the mechanisms of ceritinib,a novel candidate from the active compound pools previously screened for the regulation of sperm function. Methods The vigor sperm of human and mouse were incubated with ceritinib for 20 seconds,and the sperm motility was evaluated by computer assistant sperm analysis (CASA).The integrity of the sperm plasma membrane and the survival ratio of sperm was assessed by hypo-osmotic swelling (HOS) assay and SYBR-14/PI staining.The damage of sperm plasma membrane was detected by electron microscope.The cytotoxicity of ceritinib to VK2/E6E7,End1/E6E7 and Ect1/E6E7 cells was measured by CCK-8 assay and fluorescent staining. Results The minimal effective concentration (MEC) of ceritinib to (5-10)×106/mL human sperm within 20 seconds was (74.87±31.46)μmol/L,which was significantly lower than the MEC of nonoxynol-9 (219.75±20.89) μmol/L measured in the same condition.The time-dose related spermostatic effects of ceritinib were measured by CASA system.Ceritinib was able to damage sperm membrane and caused sperm death with HOS and SYBR-14/PI staining.With electron microscopy,the sperm membrane was observed to be ruptured,and the heads and tails of sperm were separated by ceritinib.Ceritinib was also able to damage the epithelial cells. Conclusions Ceritinib has acute spermostatic effects and potential contraceptive effects.

ceritinib; spermostatic effects; contraceptive potential; mouse

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFC1000905);國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81671508);上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(15431903000)

R697

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.001

2017-02-16;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:diaohua@sippr.org.cn

*This work was supported by the State′s Key Project of Research and Development Plan of China (2016YFC1000905),the General Program of National Natural Science Foundation of China (81671508) and the Shanghai Science and Technology Innovation Program (15431903000).