蔣秀燕，王叢叢

(中國石油大學勝利學院化學工程學院，山東東營 257061)

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CE法分離檢測對羥基苯丙酮酸互變異構(gòu)體

蔣秀燕，王叢叢

(中國石油大學勝利學院化學工程學院，山東東營 257061)

采用毛細管電泳-安培檢測法測定了對羥基苯丙酮酸烯醇-酮式互變異構(gòu)現(xiàn)象。采用以直徑為0.3mm的碳微電極為工作電極的三電極系統(tǒng)，分離電壓18kV，毛細管長度60cm，電泳液是添加了3mmol/L的β-環(huán)糊精溶液的pH=6.60、50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，兩異構(gòu)體在15min內(nèi)實現(xiàn)基線分離。

烯醇式-酮式互變異構(gòu)體，對羥基苯丙酮酸，毛細管電泳，安培檢測

人體內(nèi)酪氨酸代謝過程中會產(chǎn)生對羥基苯丙酮酸(p-hydroxyphenylpyruvic acid，pHPP)。對羥基苯丙酮酸的測定可以幫助診斷一些代謝紊亂所引起的疾病[1-2]。目前對于水溶液中其烯醇式-酮式互變異構(gòu)現(xiàn)象的研究有高效液相色譜法[1]、電化學法[2]、毛細管電泳-紫外檢測法[3-4]等，本文利用毛細管電泳-安培檢測法(CE-AD)研究對羥基苯丙酮酸在水溶液中的互變異構(gòu)現(xiàn)象，建立了分離測定其互變異構(gòu)現(xiàn)象的新方法。

1 實驗部分

1.1 設(shè)備與試劑

實驗室自組裝毛細管電泳-安培檢測設(shè)備；未涂層石英毛細管(25μm i.d×60cm)，河北永年光纖廠；安培檢測器(BAS LC-4C型)，美國西拉斐特；無極可調(diào)高壓電源(0～30kV)，上海原子核研究所；三電極工作系統(tǒng)(工作電極為自制直徑為0.3mm的碳微電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑

電極)；HW-2000色譜工作站，南京千譜軟件有限公司。

β-環(huán)糊精(色譜純)、pHPP(色譜純)，美國Sigma化學品公司；水為Milipore高純水；其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

實驗用pHPP分別用水與甲醇溶解配制成5.0×10-3mol/L的儲備液，冷藏于冰箱。實驗時以緩沖液稀釋。實驗所用試液均需用聚乙烯濾膜(0.22 μm)過濾，超聲波除去試液中細小氣泡。實驗前，毛細管需經(jīng)堿洗、水洗清潔，經(jīng)緩沖液活化15min。實驗應(yīng)用電動進樣方式，進樣時間10s，電壓18kV，隨后電泳分離與檢測。實驗在大約20℃的室溫下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 pHPP烯醇式與酮式互變異構(gòu)平衡

文獻[4]報道，pHPP以甲醇配置溶液冷藏放置數(shù)十天不會發(fā)生異構(gòu)轉(zhuǎn)化，但pHPP在水溶液中發(fā)生由烯醇式(圖1-A)向酮式(圖1-B)轉(zhuǎn)化的異構(gòu)現(xiàn)象，平衡時多以酮式異構(gòu)體存在。

圖1 pHPP的互變異構(gòu)體

2.2 檢測電位

毛細管電泳-安培檢測中，工作電極上電位的選擇對檢測的靈敏度、檢測限和穩(wěn)定性有重要的影響。在添加了3mmol/L的β-環(huán)糊精溶液的pH=6.60、50mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，考察了pHPP烯醇式與酮式異構(gòu)體的動態(tài)伏安性質(zhì)。取異構(gòu)充分的pHPP水溶液進行實驗。烯醇式與酮式異構(gòu)體的峰電流隨檢測電位的升高均顯著增大；pHPP兩異構(gòu)體的峰電流在檢測電位低于0.80V時明顯減小；在高于1.00V的檢測電位下，信噪比降低，基流升高；選擇1.00V為工作電極的檢測電位。

2.3 緩沖液

比較幾種常見緩沖液(硼砂-磷酸二氫鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸鹽緩沖液，pH=6.60)對分離的影響。發(fā)現(xiàn)在磷酸鹽緩沖體系中兩種異構(gòu)體的分離效果較好，峰形較對稱。

考察濃度范圍40mmol/L～80mmol/L的磷酸鹽緩沖液對pHPP兩種異構(gòu)體分離行為的影響。兩種異構(gòu)體在緩沖液濃度低于50mmol/L時不能實現(xiàn)分離；在緩沖液濃度達到70mmol/L時，峰展寬，靈敏度降低，遷移時間延長。實驗選定磷酸鹽緩沖液濃度為50mmol/L。

考察pH值的影響，兩種互變異構(gòu)體在pH值大于6.10時實現(xiàn)分離；在pH=6.50時峰形變對稱；繼續(xù)升高pH值，峰展寬，遷移時間變長。實驗選定pH=6.60為最佳pH值。

2.4 添加劑

β-環(huán)糊精與待測組分形成包合物有助于待測物的分離，也是選擇β-環(huán)糊精作為添加劑的原因。β-環(huán)糊精分子結(jié)構(gòu)是一個內(nèi)空去頂、上寬下窄的錐形體，由7個D-(+)-吡喃葡萄糖組成。錐形體外部分布著分子中所有羥基，其中在寬口端順時針方向指向排列著7個羥基，糖苷氧原子和氫原子位于其空腔內(nèi)。該結(jié)構(gòu)特點使β-環(huán)糊精具有親水性外殼與疏水性內(nèi)腔，易與一些有機物質(zhì)形成主-客體包合物。pHPP分子中苯環(huán)靠其疏水作用由β-環(huán)糊精分子的錐形體寬口端進入，在腔內(nèi)二者形成包合物，靠氫鍵作用結(jié)合兩分子，其中β-環(huán)糊精與烯醇式結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體間氫鍵作用更強，使包合物更穩(wěn)定，并減少了其所帶負電荷，使其出峰早于酮式異構(gòu)體。

圖2 β-環(huán)糊精與pHPP形成包合物的圖示

考察了β-環(huán)糊精濃度在1mmol/L～5mmol/L范圍內(nèi)對分離效果的影響。加入β-環(huán)糊精增加了分離度，縮短了待測物遷移時間，改善了峰展寬；但當β-環(huán)糊精的濃度增加到4mmol/L時，兩種互變異構(gòu)體由于出峰時間的提前不能完全分開。Wren和Rowe[5]認為，添加劑存在一個最優(yōu)濃度，大小受形成包合物的兩物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)的影響；二者結(jié)合常數(shù)越小，所需添加劑濃度越高，反之則越低。同時加入β-環(huán)糊精使峰電流降低，由于β-環(huán)糊精是電中性的化合物，與待測物質(zhì)包合后，使pHPP所帶凈負電荷減少，遷移速度加快。結(jié)合分離效果與出峰時間，選定3mmol/L為實驗最佳添加劑濃度。

2.5 進樣時間

進樣時間過短則峰電流小，影響檢測靈敏度；進樣時間過長則會因樣品的擴散引起峰展寬，使分離效率與分離度下降；綜合考慮，設(shè)定進樣時間10s。

2.6 分離電壓

電泳速度、毛細管中的電場強度均由分離電壓的大小來決定，分離度與分析時間進而受其影響。分離電壓低于15kV時，分離物在毛細管內(nèi)嚴重擴散，導致譜峰展寬、靈敏度下降；分離電壓越大，出峰時間越短；但焦耳熱增加，基流增高。綜合考慮，選擇18kV為實驗電壓。在以上所有最佳實驗條件下，待測物的毛細管電泳譜圖如圖3所示。實驗條件：5.0×10-5mol/L的 pHPP水溶液；pH=6.60，濃度為50mmol/L的PBS緩沖液；25μm i.d×60cm的毛細管；0.3mm碳圓盤微工作電極；1.00V的檢測電位；10s的進樣時間；18kV的分離電壓。

A pHPP的烯醇式結(jié)構(gòu) B pHPP的酮式結(jié)構(gòu)

圖3 pHPP標準水溶液的電泳圖

Fig.3 The electropherogram of standard solution of pHPP

2.7 方法重現(xiàn)性、線性范圍與檢測下限

在實驗條件下，通過對5.0×10-6mol/L的pHPP標準溶液重復(fù)進樣分析，對方法的重現(xiàn)性進行考察。峰高和遷移時間的相對標準偏差(RSD，n=3)分別為2.92%和3.26% 。

配制pHPP甲醇溶液，使pHPP完全以烯醇式結(jié)構(gòu)存在，分別稀釋為1.0×10-5mol/L～1.0×10-8mol/L濃度范圍的待測溶液，對方法的線性范圍進行考察，檢測下限依據(jù)三倍信噪比原則確定，結(jié)果見表1。

表1 線性范圍和檢測下限

3 結(jié)論

應(yīng)用毛細管電泳-安培檢測法在β-環(huán)糊精做添加劑的條件下研究了對羥基苯丙酮酸的烯醇式與酮式異構(gòu)體的拆分。結(jié)果表明，緩沖體系對異構(gòu)體的分離與分析有很大的影響，選擇合適的緩沖溶液及控制合適的pH值使分離有很大的提高，同時添加劑的選擇使分離產(chǎn)生了很好的效果。

[1] 黃穎，張曉麗，陳國南.高效液相色譜法研究對羥基苯丙酮酸烯醇-酮式互變異構(gòu)動力學[J].福建師范大學學報：自然科學版，2009，25(3)：77-79.

[2] 黃穎，張曉麗，占春榮，等.多壁碳納米管修飾玻碳電極用于對羥基苯丙酮酸的電化學研究[J].福建師范大學學報：自然科學版，2010，26(3)：47-51.

[3] 郭晴，常理文，陳義.尿中微量芳香酸的高效毛細管電泳分析——用于苯丙酮尿癥的診斷[J].分析化學，2001(9)：1000-1002.

[4] HUANG Lu，HUANG Ying，CHI Yu-wu，et al. Study on the kinetics of keto-enol tautomerism of P-hydroxyphenylpyruvic Acid using capillary electrophoresis [J]. J Chromatogr A，2007，10(78)：44-49.

[5] Wren S A C，Lukacs K D. Theoretical aspects of chiral separation in capillary electrophoresis：I. Initial evaluation of a model[J]. J Chromatogr A，1992，603：235-241.

Determination of the Tautomerization of p-Hydroxyphenylpyruvic Acid by CE

JIANG Xiu-yan，WANG Cong-cong

(School of Chemical Engineering Shengli College China University of Petroleum，Dongying 257061，Shandong，China)

The enol-keto tautomerism of p-hydroxyphenylpyruvic acid was investigated by capillary electrophoresis with amperometric detection. A three electrode system with a carbon microelectrode (i.d. 0.3mm) as the working electrode was used. The two tautomers were separated and detected within 15min at 18kV of applied voltage and a 60cm (i.d. 25μm) length capillary in 50mmol/L phosphate buffer (pH=6.60) including 3mmol/Lβ-cyclodextrin.

the enol-keto tautomerism，hydroxyphenylphruvic acid，capillary electrophoresis，amperometric detection

O 657.8