唐菀澤，馬衛(wèi)列，丁航，向樂，張志珍

（廣東醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，廣東 東莞 523808）

氧化芍藥苷對泡沫細胞膽固醇流出的影響

唐菀澤，馬衛(wèi)列，丁航，向樂，張志珍

（廣東醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，廣東 東莞 523808）

目的分析氧化芍藥苷對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響。方法THP-1細胞加入160 nmol/L佛波酯（PMA）24 h，再加入50 μg/ml乙?；兔芏戎鞍祝╝c-LDL）建立泡沫細胞模型，CCK-8法測定氧化芍藥苷的細胞毒性，同位素標記法測定各處理組泡沫細胞膽固醇流出率。共聚焦顯微鏡觀察泡沫細胞內脂肪分化相關蛋白（ADFP）表達變化，Western blot分析泡沫細胞中ADFP、三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）和過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）蛋白表達變化。結果成功建立THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞模型。氧化芍藥苷毒性分析表明，質量濃度在200.0μg/ml以下無細胞毒性。150.0μg/ml與200.0μg/ml氧化芍藥苷處理泡沫細胞，膽固醇流出率分別為（10.317±0.508）%與（11.265±0.713）%，與apoA-1組相比，差異有統(tǒng)計學意義（<0.05），均高于apoA-1組。氧化芍藥苷處理的泡沫細胞內ADFP熒光明顯減弱。Western blot分析泡沫細胞ADFP表達量降低28%。氧化芍藥苷處理組PPARα表達量增加51%，ABCA1表達量增加45%。結論實驗表明氧化芍藥苷可通過上調PPARα增加ABCA1表達，進而促進泡沫細胞膽固醇流出。

氧化芍藥苷；THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞；膽固醇流出

Keywords:Oxypaeoniflora;THP-1 macrophage-derived foam cell;cholesterol efflux

動脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病是危害人類健康的重要疾病，中國每年死于心血管疾病者近350萬例，已成為我國居民的首位死亡原因[1]。膽固醇在巨噬泡沫細胞中積累是動脈粥樣硬化形成的關鍵因素，促進泡沫細胞內膽固醇的逆向轉運是防治動脈粥樣硬化的有效方法[2]。三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）以ATP為能源，促進細胞內游離膽固醇和磷脂流向貧脂的載脂蛋白A-1（apolipoprotein A-1，apoA-1），通過增加高密度脂蛋白的形成啟動膽固醇逆向轉運，進而促進泡沫細胞中膽固醇的外流[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白芍水提物可通過上調泡沫細胞ABCA1蛋白表達，促進細胞內膽固醇的流出。本實驗擬在此基礎上，以氧化芍藥苷作為研究對象，借助人外周血單核細胞系（THP-1）巨噬細胞源性泡沫細胞模型，研究氧化芍藥苷對泡沫細胞膽固醇外流的影響，并初步分析其作用機制，為發(fā)現(xiàn)新的抗動脈粥樣硬化性心血管疾病潛在藥物提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人單核細胞株THP-1購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心，氧化芍藥苷購自北京欣榮科技有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，佛波酯（phorbol-1-myristate-13-acetate，PMA）購自美國Promega公司，乙?；兔芏戎鞍祝╝cetylated low-density lipoprotein，ac-LDL）購自美國Biochemical Techologies公司，3H標記膽固醇（[3H]-膽固醇）購自美國PerkinElmer公司，apoA-1購自美國Sigma公司。兔抗ABCA1抗體購自美國Sigma公司，兔抗脂肪分化相關蛋白（adipose differentiation-related protein，ADFP）抗體、兔抗過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα）抗體購自美國Abcam公司，兔抗GAPDH抗體購自杭州至賢生物公司，HRP標記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司，驢抗兔Alexa Fluor 555二抗購自廣州碧云天生物科技公司，含核熒光染料DAPI的抗熒光淬滅劑購自美國Cell Signaling Technology公司。BCA試劑盒購自廣州碧云天生物科技公司，CCK-8試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司。其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)THP-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。觀察細胞生長情況，2～3 d后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立

THP-1細胞傳代至6孔板（2×106個/孔），加入PMA至終濃度160 nmol/L，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，使懸浮細胞分化為貼壁巨噬細胞。更換培養(yǎng)基，加入ac-LDL至終濃度50μg/ml，繼續(xù)孵育48 h，誘導貼壁巨噬細胞分化為泡沫細胞。同時設PMA對照組。

1.2.3 CCK-8法測定氧化芍藥苷的細胞毒性

THP-1細胞接種96孔板（4×103個/孔），按照上述方法建立泡沫細胞模型。每孔加入100μl不同質量濃度的氧化芍藥苷（10.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0μg/ml），每個質量濃度設4個平行重復孔，同時設空白對照組和細胞對照組。培養(yǎng)24 h，吸出每孔藥物溶液，加入100μl含10%CCK-8的1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀測定450 nm吸光度。根據(jù)各組之平均吸光度值計算細胞的存活率。

1.2.4 同位素標記法檢測泡沫細胞膽固醇流出率

THP-1細胞接種24孔板（4×105個/孔），PMA作用24 h；加入[3H]-膽固醇（終濃度為0.2μCi/ml）和ac-LDL（終濃度為50μg/ml），5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h，誘導細胞分化為泡沫細胞。每孔加入500μl氧化芍藥苷溶液（終濃度分別為150.0和200.0μg/ml）作用24 h后，加入含apoA-1的1640培養(yǎng)基（apoA-1終濃度為10μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同時設ac-LDL組和apoA-1組，每組設3個平行重復孔。液體閃爍計數(shù)法測定培養(yǎng)基和細胞裂解液中的放射強度，放射強度以cpm值計（cpm值為[3H]-膽固醇放射強度每分鐘計數(shù)）。泡沫細胞膽固醇流出率按下列公式計算：膽固醇流出率（%）=培養(yǎng)基內cpm/（細胞內cpm+培養(yǎng)基中cpm）×100。參照文獻[5]方法進行。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察氧化芍藥苷處理的泡沫細胞內ADFP表達變化THP-1細胞接種24孔板（2×105個/孔），建立泡沫細胞模型，同時制作細胞爬片。泡沫細胞加入200.0μg/ml氧化芍藥苷作用24 h，再加入apoA-1作用24 h。1×PBS漂洗細胞，加入4%多聚甲醛固定30 min；加入0.1%TritonX-100-PBS冰上透化細胞15 min；加入2%BSA-PBS封閉細胞1 h。加入ADFP抗體（1∶300）4℃過夜；1×PBS漂洗細胞，加入Alexa Fluor 555二抗（1∶1 000），室溫避光1 h；滴加含核熒光染料DAPI的抗熒光淬滅劑封片。置激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。參照文獻[6]方法進行。

1.2.6 Western blot分析泡沫細胞中ADFP、ABCA1和PPARα的表達THP-1細胞接種6孔板（2×106個/孔），實驗分ac-LDL組、apoA-1組和氧化芍藥苷處理組。泡沫細胞加入200.0μg/ml氧化芍藥苷作用24 h后，加入apoA-1繼續(xù)培養(yǎng)24 h。提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。12%分離膠進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上，加入兔抗ADFP一抗（1∶1 000）、兔抗ABCA1一抗（1∶500）與兔抗PPARα一抗（1∶500），4℃過夜，加入HRP標記的二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h后ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有實驗重復3次。采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)標準差±s）表示，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，兩兩比較用LSD-檢驗，<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氧化芍藥苷對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的毒性

實驗中所用的氧化芍藥苷純度在98%以上（見圖1和表1）。CCK-8法測定顯示，氧化芍藥苷質量濃度為300.0μg/ml時，泡沫細胞存活率為（35.375±4.762）%；質量濃度為250.0μg/ml時，泡沫細胞存活率為（52.800±6.004）%；質量濃度為200.0μg/ml時，泡沫細胞存活率為（94.375±2.584）%。氧化芍藥苷的半數(shù)細胞毒性濃度CC50=250μg/ml，實驗結果提示，當質量濃度在200.0μg/ml以下時，氧化芍藥苷無細胞毒性（見圖2）。

2.2 氧化芍藥苷對泡沫細胞膽固醇流出率的影響

ac-LDL組泡沫細胞膽固醇流出率為：（2.116±0.496）%，apoA-1作用泡沫細胞24 h，膽固醇流出率為（8.919±0.953）%。分別用150.0和與200.0μg/ml氧化芍藥苷處理泡沫細胞24 h，膽固醇流出率分別為（10.317±0.508）%和（11.265±0.713）%。經單因素方差分析，各處理組的膽固醇流出率差異有統(tǒng)計學意義。進一步兩兩比較顯示，與ac-LDL組比較，apoA-1處理后泡沫細胞膽固醇流出率升高，差異有統(tǒng)計學意義（=12.028，=0.000）；與apoA-1組比較，150.0和200.0μg/ml氧化芍藥苷處理泡沫細胞，膽固醇流出率相繼升高，差異有統(tǒng)計學意義（=2.472和4.148，=0.039和0.003）（見圖3）。后續(xù)實驗中選用200.0μg/ml濃度進行分析。

2.3 氧化芍藥苷處理的泡沫細胞ADFP表達變化

圖1 氧化芍藥苷的純度

表1 氧化芍藥苷純度的具體數(shù)據(jù)

圖2 氧化芍藥苷對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的毒性測定

激光共聚焦顯微鏡觀察，泡沫細胞內有大量ADFP紅色熒光，在整個細胞內呈點狀分布（見圖4A）。apoA-1處理的泡沫細胞內ADFP熒光明顯減弱，且大多集中在靠近細胞膜邊緣的位置（箭頭所示，見圖4B）；而氧化芍藥苷處理的泡沫細胞內，ADFP熒光強度相比apoA-1組更弱（見圖4C）。

Western blot分析不同處理組泡沫細胞ADFP的表達變化，結果顯示，氧化芍藥苷處理的泡沫細胞內ADFP蛋白表達明顯降低（見圖5A）。蛋白灰度分析表明，ac-LDL組、apoA-1組、氧化芍藥苷處理組的ADFP相對表達量分別為（1.409±0.051）、（0.983±0.045）及（0.707±0.059），各處理組的ADFP表達差異有統(tǒng)計學意義。進一步兩兩比較顯示，氧化芍藥苷處理組的ADFP表達比apoA-1組降低，差異有統(tǒng)計學意義（=6.502，=0.001）（見圖5B）。結果提示，氧化芍藥苷可介導泡沫細胞內膽固醇的流出。

圖3 氧化芍藥苷處理的泡沫細胞膽固醇流出率

2.4 泡沫細胞ABCA1與PPARα表達變化

Western blot分析泡沫細胞ABCA1與PPARα的相對表達量。氧化芍藥苷處理泡沫細胞24 h后，ABCA1蛋白與PPARα蛋白的表達明顯升高（見圖6A和圖7A）。經單因素方差分析，ac-LDL組、apoA-1組、氧化芍藥苷處理組的ABCA1表達差異有統(tǒng)計學意義；氧化芍藥苷處理的泡沫細胞ABCA1的相對表達量為（1.500±0.022），進一步與apoA-1組比較，氧化芍藥苷處理組ABCA1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義0.000）（見圖6B）。

圖5 泡沫細胞ADFP表達

圖6 泡沫細胞ABCA1表達

圖7 泡沫細胞PPARα表達

3 討論

動脈粥樣硬化是一種以膽固醇在動脈內膜沉積為特征的慢性疾病。巨噬細胞源性泡沫細胞的形成在動脈粥樣硬化發(fā)生和進展中起到關鍵作用。促使膽固醇從巨噬細胞中外流對阻止泡沫細胞形成以及防止動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義[7]。

白芍來源于雙子葉植物毛茛科芍藥屬植物的干燥根，為我國傳統(tǒng)中藥及臨床常用藥物之一?，F(xiàn)代醫(yī)學對白芍藥理的研究多側重于其對神經、消化、免疫等系統(tǒng)的作用，而其對心血管系統(tǒng)的研究報道較少。研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能提高組織細胞中cAMP水平，抑制炎癥因子產生[8]；白芍制劑可明顯抑制中性粒細胞cAMP-PDE活性，而發(fā)揮抗炎癥效果[9-10]。魏毅等[11]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖與白芍總苷配伍可有效促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內脂質流出，而確切作用機制未見報道。白芍的有效部位包括芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內酯苷及羥基芍藥苷等一系列糖苷類物質[12]。本研究在前期實驗中，以水與95%乙醇作為提取溶劑，通過水提醇沉，旋轉蒸發(fā)、濃縮等方法得到白芍提取物。研究發(fā)現(xiàn)白芍水提取物有促進泡沫細胞膽固醇流出作用，故本實驗進一步選取白芍單體—氧化芍藥苷作為研究對象，分析其對泡沫細胞膽固醇流出的影響及可能的機制。

氧化芍藥苷細胞毒性實驗得知，其半數(shù)細胞毒性濃度CC50為250.0μg/ml，質量濃度200.0μg/ml以下無細胞毒性，且200.0μg/ml氧化芍藥苷對泡沫細胞膽固醇流出有明顯作用，故后續(xù)實驗中，選取200.0μg/ml作為實驗濃度。與apoA-1組比較，氧化芍藥苷處理組膽固醇流出率增加26%，提示氧化芍藥苷有促進泡沫細胞膽固醇流出作用。為了驗證此實驗結果，進一步采用激光共聚焦顯微鏡觀察氧化芍藥苷處理的泡沫細胞內ADFP的表達變化。ADFP是一種脂肪分化相關蛋白，是apoA-1介導的膽固醇流出通路中的轉運囊泡的組成部分[6]，是THP-1巨噬細胞脂質沉積和動脈粥樣硬化病變的標志性物質[13-14]。共聚焦顯微鏡觀察到ac-LDL泡沫細胞組有大量ADFP紅色熒光蛋白表達，且在整個細胞內點狀分布，apoA-1組及氧化芍藥苷處理組紅色熒光相繼減弱且多集中于細胞膜邊緣位置。同時，采用Western blot方法分析泡沫細胞內ADFP的表達變化，氧化芍藥苷處理后ADFP表達量較apoA-1組降低28%。ADFP的鏡下觀察與Western blot實驗結果均提示，氧化芍藥苷具有促使泡沫細胞膽固醇流出的作用。

高密度脂蛋白介導膽固醇從巨噬泡沫細胞流出是清除細胞內過量膽固醇的最主要途徑，膽固醇以囊泡分泌形式進行轉運，在此過程中有apoA-1的介導[15]。大量研究證實，ABCA1是細胞內膽固醇和磷脂轉運到apoA-1的主要運輸者，這一步驟是體內新生高密度脂蛋白顆粒形成的必須步驟。PPARs是一種調控糖類和脂質代謝的核受體，在哺乳動物中有3種亞型：PPARα、PPARβ和PPARγ。其中PPARα高表達于脂肪酸代謝旺盛的組織如心臟、肝臟、腎臟、肌肉和動脈血管壁中的各種細胞如巨噬細胞及內皮細胞。PPARs已被實驗證實具有抗動脈粥樣硬化的作用[16]。PPARα被相應配體活化后，能夠增強脂肪酸的β氧化；而且PPAR為ABCA1的轉錄因子，PPARα增加伴隨著ABCA1表達量提高，說明PPARα能夠正向調節(jié)ABCA1的表達，促進膽固醇的流出。本實驗中Western blot分析PPARα蛋白表達變化，與apoA-1組比較，200.0μg/ml氧化芍藥苷處理泡沫細胞后，PPARα表達量增加51%，同時ABCA1表達量上調45%。提示，氧化芍藥苷可通過上調PPARα、進而促進基因表達增加泡沫細胞的膽固醇流出。該研究結果為開發(fā)抗動脈粥樣硬化有效新藥提供了實驗數(shù)據(jù)。

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（張蕾編輯）

Effect of Oxypaeoniflora on cholesterol efflux from foam cells

Wan-ze Tang,Wei-lie Ma,Hang Ding,Le Xiang,Zhi-zhen Zhang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical University,Dongguan,Guangdong 523808,China)

ObjectiveTo analyze the effect of Oxypaeoniflora on cholesterol efflux from THP-1 macrophagederived foam cells.MethodsTHP-1 cells were treated with 160 nmol/L phorbol-1-myristate-13-acetate(PMA)for 24 h,then 50 μg/ml acetylated low-density lipoprotein(ac-LDL)to establish foam cell model.Cytotoxicity of Oxypaeoniflora was assessed by CCK-8.Cholesterol efflux rate of the foam cells in each treatment group was evaluated by isotope labeling method.The expression of adipose differentiation related protein(ADFP)in the foam cells was observed by confocal laser scanning microscopy.The expression changes of ADFP,ATP binding cassette transporter A1(ABCA1)and peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARα)in the foam cells were detected using Western blot.ResultsThe THP-1 macrophage-derived foam cell model was successfully established.At the concentration of lower than 200.0 μg/ml,Oxypaeoniflora was not cytotoxic.When the Oxypaeoniflora concentrations were 150.0 μg/ml and 200.0 μg/ml,the cholesterol efflux rates were about(10.317±0.508)%and(11.265±0.713)%respectively,which were increased compared with the control group(<0.05).Under microscope,the fluorescence of ADFP in the Oxypaeoniflora groups was obviously decreased.Western blot indicated that the expression of ADFP was decreased by 28%,while the expressions of PPARα and ABCA1 were increased by 51%and 45%respectively.ConclusionsThe results state clearly Oxypaeoniflora can increase the expression of ABCA1 by up-regulation of PPARα expression and then promote the cholesterol efflux from foam cells.

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.002

1005-8982（2017）16-0006-06

R282；Q54

A

2017-01-03

張志珍，E-mail：zzzhang@gdmu.edu.cn