史東杰 梁擁軍 饒青 朱莉飛 張升利

摘要：以錦鯉胚胎為研究對(duì)象，分別在受精初期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期取樣，測(cè)定魚卵受精初期及胚胎發(fā)育不同時(shí)期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性及丙二醛含量。結(jié)果顯示，錦鯉魚卵受精初期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性及丙二醛含量均較低，隨著胚胎發(fā)育，酶活性及丙二醛含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)育至原腸期時(shí)，酶活性及丙二醛含量均顯著升高（P<0.05）；當(dāng)胚胎發(fā)育至出膜前期時(shí)，酶活性及丙二醛含量繼續(xù)上升，且顯著高于以前各時(shí)期（P<0.05）。此時(shí)期，超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性及丙二醛（MDA）含量分別為受精初期的1.78、3.62、23.41、1.92倍。

關(guān)鍵詞：超氧化物歧化酶；磷酸酶；丙二醛；胚胎發(fā)育；錦鯉

中圖分類號(hào)： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0120-03[HS）][HT9.SS]

魚類在殼內(nèi)的發(fā)育階段稱為胚胎發(fā)育，該階段是魚類個(gè)體發(fā)育最為關(guān)鍵的時(shí)期。在魚類早期發(fā)育生物學(xué)中，通常將魚類的胚胎發(fā)育分為受精期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期等多個(gè)時(shí)期。魚類的細(xì)胞分化和組織、器官發(fā)育等均在胚胎發(fā)育過程中開始發(fā)生，因此魚類胚胎發(fā)育過程中生理代謝十分活躍[1]。同時(shí)，整個(gè)胚胎發(fā)育過程中只有卵殼的保護(hù)，易受到外界環(huán)境的破壞，因此需要較強(qiáng)的抗菌和免疫能力。酶是機(jī)體活細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物催化劑，生命活動(dòng)中的各類代謝化學(xué)反應(yīng)、免疫反應(yīng)均為酶促反應(yīng)，因而特定酶的催化能力代表了機(jī)體特定動(dòng)能的發(fā)育情況。超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，是機(jī)體清除超氧陰離子自由基的首要物質(zhì)，它可對(duì)抗和阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并可及時(shí)修復(fù)和保護(hù)細(xì)胞。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）是非特異性磷酸單酯水解酶，分別在酸性和堿性環(huán)境下起催化作用，在動(dòng)物DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂類及機(jī)體免疫等代謝過程中起著重要的調(diào)控作用。丙二醛（MDA）含量通常被認(rèn)為可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)，并具有毒性。因此，SOD、ACP、AKP這3種酶活性及MDA含量的變化可以反映動(dòng)物機(jī)體生理生態(tài)變化、免疫機(jī)能及健康狀況[2-5]。本研究以錦鯉（Cyprinus carpio L.）為研究對(duì)象，旨在通過研究錦鯉胚胎發(fā)育過程中SOD、ACP、AKP這3種酶活性及MDA含量的變化規(guī)律，探討魚類胚胎發(fā)育過程和代謝調(diào)控機(jī)理。

1材料與方法

1.1受精卵采集

通過人工催產(chǎn)、干法受精，獲得受精卵，隨機(jī)分為3組，約1 000粒/組，置于含有500 mL試驗(yàn)用水的培養(yǎng)皿（直徑 20 cm，高3 cm）中孵化。魚卵剛受精時(shí)立即取樣，然后用顯微鏡連續(xù)觀察受精卵，在以下各取樣點(diǎn)進(jìn)行取樣，取樣點(diǎn)分別為：受精初期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期，每個(gè)取樣點(diǎn)采集魚卵或胚胎約100粒（個(gè)）/皿，用濾紙吸干水，置于離心管中，-80 ℃保存待測(cè)。試驗(yàn)用水為經(jīng)過曝氣的自來水，水溫為（18±1）℃，pH值7.4，溶解氧≥5 mg/L，每24 h換水約1/2。胚胎發(fā)育過程中，及時(shí)清除未受精卵、死卵及異常發(fā)育的胚胎。

1.2樣品制備與測(cè)定

樣品制備參照孔祥會(huì)等的方法[6]進(jìn)行。粗提液蛋白定量參照Bradford的測(cè)定方法[7]進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白（BSA，購(gòu)于AMRESCO公司）。超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）的活性及丙二醛（MDA）的含量，均采用北京澳聯(lián)雅實(shí)驗(yàn)設(shè)備中心的試劑盒進(jìn)行，具體測(cè)定方法參照試劑盒說明書。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*5]±s）（n=6，3個(gè)平行，2個(gè)重復(fù)）表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，用多重比較法進(jìn)行組間差異顯著性分析，顯著水平為0.05。

2結(jié)果與分析

在顯微鏡下觀察，水溫為（18±1）℃、pH值為7.4、DO（溶氧量）≥5 mg/L 等的條件下，受精卵在受精192 min發(fā)育至16胞期，305 min發(fā)育至囊胚晚期、1 263 min發(fā)育至原腸晚期、2 418 min 發(fā)育至心跳形成期、3 512 min發(fā)育至出膜前期。試驗(yàn)過程中，各取樣點(diǎn)涵蓋了胚胎發(fā)育從受精至剛孵化出仔魚整個(gè)過程。

2.1超氧化物歧化酶活性的變化

由圖1可知，錦鯉胚胎發(fā)育過程中SOD活性變化呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。在受精初期，SOD的活性最低，為（48.252±2.43）U/mg；發(fā)育至囊胚期、原腸期時(shí)分別為（50.309±2.14）、（53.251±2.32）U/mg，差異不顯著（P>0.05）；由原腸期經(jīng)胚體及器官形成期，至出膜前期SOD活性顯著上升（P<0.05），在出膜前期達(dá)到最高，為（85.981±3.25）U/mg，為受精初期的1.78倍。

2.2酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活性變化[JP2]

由圖2可知，錦鯉胚胎發(fā)育過程中ACP、AKP活性的變化均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，并具有協(xié)同性。[JP]在受精初期，ACP、AKP的活性最低，分別為（1.158±0.024）、（0.026±0.013）U/g；[JP]當(dāng)發(fā)育至原腸期時(shí)，酶活性明顯增強(qiáng)，分別為（2.679±0031）、（0.042±0.005） U/g，[CM（12*2]與之前各時(shí)期相比差異顯著[CM）]

（P<0.05）；當(dāng)發(fā)育至胚體及器官形成期時(shí)，ACP、AKP的活性分別上升至（2.738±0.025）、（0.048±0.008）U/g，但與原腸期相比差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)發(fā)育至出膜前期時(shí)，酶活性繼續(xù)上升，且顯著高于以前各個(gè)時(shí)期（P<0.05），此時(shí)期ACP、AKP的活性分別為受精初期的3.62、23.41倍。

2.3丙二醛含量的變化

由圖3可知，錦鯉胚胎發(fā)育過程中MDA的含量呈現(xiàn)出逐漸增多的趨勢(shì)。受精初期MDA含量最低，為（8.023±0.42）nmol/mg，從受精初期發(fā)育至卵裂期、囊胚期MDA含量無顯著性變化（P>0.05）；當(dāng)發(fā)育至原腸期時(shí)MDA含量為（10.295±0.56）nmol/mg，顯著增多（P<0.05）；當(dāng)發(fā)育至出膜前期時(shí)，MDA含量繼續(xù)上升至（15.436±0.81）nmol/mg，且顯著高于以前各個(gè)時(shí)期（P<0.05），為受精初期的192倍。

3討論

胚胎發(fā)育過程中各種酶的作用極為復(fù)雜，其活性變化也受到多種因子的影響，尤其是胚胎發(fā)育后期要經(jīng)歷神經(jīng)管、脊索、肌節(jié)、尾芽、心臟等的形成。同時(shí)，胚胎運(yùn)動(dòng)、胚胎孵化等均需要大量的生理代謝和信息傳導(dǎo)。在本研究中，超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性在錦鯉胚胎發(fā)育過程中持續(xù)協(xié)同增加，主要是滿足胚胎發(fā)育的需要。

Swain等認(rèn)為魚類主要通過卵子母源性抗體傳遞給子代[8-9]。并有研究顯示，生命早期發(fā)育過程中免疫力也可由自身的合子基因表達(dá)[10]。熊鏵龍等在研究普安銀鯽（Carassius auratus）胚胎發(fā)育中，抗氧化酶活性變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)在普安銀鯽早期發(fā)育中，超氧化物歧化酶在成熟卵子中就具有活性，說明普安銀鯽胚胎發(fā)育中超氧化物歧化酶是由母體傳遞而來，并非胚胎合子基因的合成[11]。Kumano等對(duì)海鞘（Halocynthia roretzi）胚胎中堿性磷酸酶活性的研究顯示，胚胎中雖然含有少量母源性堿性磷酸酶，但是在胚胎內(nèi)胚層發(fā)育時(shí)堿性磷酸酶主要來源于堿性磷酸酶基因的表達(dá)[12]。在本研究中，首次取樣點(diǎn)為受精初期，即在魚卵剛受精時(shí)立即取樣，可見樣品中應(yīng)含有受精卵和成熟卵子，通過生化測(cè)定超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶均具有活性，因?yàn)閯偸芫⒓慈?，胚胎合子基因還未進(jìn)行充分的表達(dá)、合成，所以初步判斷錦鯉胚胎發(fā)育過程中超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶可由母體帶來，屬于母源性酶類。隨著錦鯉胚胎的持續(xù)發(fā)育，以上3種酶活性逐漸增加，這種變化趨勢(shì)與王書平等對(duì)金魚（Carassius auratus）胚胎[13]、孔祥會(huì)等對(duì)金魚胚胎[14]、熊鏵龍等對(duì)普安銀鯽的研究[11]基本相似。在本研究中，以胚胎發(fā)育至原腸期為節(jié)點(diǎn)，除超氧化物歧化酶外，其余2種酶活性均顯著上升（P<0.05），是否有合子基因開始表達(dá)，還有待進(jìn)一步研究。當(dāng)胚胎發(fā)育至出膜前期時(shí)，酶活性繼續(xù)上升，且顯著高于以前各個(gè)時(shí)期（P<0.05），此時(shí)期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性分別為受精初期的1.78、3.62、23.41倍，這時(shí)可能是有合子基因表達(dá)參與代謝的結(jié)果。因?yàn)樵谂咛グl(fā)育至出膜前期時(shí)，卵黃囊中貯存的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)基本耗盡，這時(shí)酶活性的增強(qiáng)可能是由于合子基因表達(dá)的結(jié)果。

在本研究中，錦鯉魚卵受精初期丙二醛含量最低，說明抗氧化能力較強(qiáng)。但是，隨著胚胎發(fā)育，丙二醛含量逐漸增多，說明胚胎發(fā)育過程中持續(xù)發(fā)生一定的氧化應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)胚胎發(fā)育至原腸期時(shí)，丙二醛含量顯著增多（P<0.05），為激烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)所致，此時(shí)應(yīng)為胚胎免疫力和抗氧化能力較弱的時(shí)期，此時(shí)期一定要增強(qiáng)胚胎管理，才可提高胚胎孵化率和成活率。當(dāng)發(fā)育至出膜前期時(shí)，卵黃囊內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本耗盡，機(jī)體需要更為旺盛的生理代謝來滿足發(fā)育的需要，此時(shí)期應(yīng)為產(chǎn)生活性氧自由基最多的時(shí)期，同時(shí)出膜過程中仔魚與水體直接接觸，水體環(huán)境因子也可刺激其產(chǎn)生一定的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致丙二醛含量上升，這就可以解釋本研究所產(chǎn)生的結(jié)果。這與熊鏵龍等對(duì)普安銀鯽胚胎[11]、Elena-Díaz等對(duì)鱘魚（Acipenser sturio Linnaeus）胚胎的研究結(jié)果[15]一致。同時(shí)，說明出膜期為受精卵孵化又一關(guān)鍵時(shí)期，在此時(shí)期一定要強(qiáng)化管理，避免胚胎受到各種因素的干擾，同時(shí)要保持適宜的水質(zhì)條件，以保持胚胎正常的發(fā)育進(jìn)程，切不可延長(zhǎng)孵化時(shí)間。

4結(jié)論

本研究顯示，在錦鯉胚胎發(fā)育過程中超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性逐漸升高，說明錦鯉胚胎生理代謝逐漸旺盛，信息傳導(dǎo)增多，酶活性持續(xù)協(xié)同增加，主要是滿足胚胎發(fā)育的需要。丙二醛含量逐漸增多，說明胚胎發(fā)育過程中持續(xù)發(fā)生一定的氧化應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)胚胎發(fā)育至原腸期、出膜前期時(shí)，丙二醛含量均顯著上升，所以這2個(gè)時(shí)期是胚胎發(fā)育免疫能力較弱的時(shí)期，一定要強(qiáng)化管理，避免胚胎受到各種因素的干擾。

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