劉山秀 姜相君

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科(266000)

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胃癌組織中MGMT基因甲基化與DNMT1蛋白表達的關(guān)系

劉山秀 姜相君*

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科(266000)

背景：研究表明MGMT基因啟動子區(qū)甲基化與包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤密切相關(guān)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)在多種腫瘤組織中的表達上調(diào)。但目前關(guān)于胃癌組織中MGMT基因甲基化狀態(tài)與DNMT1表達關(guān)系的研究少見。目的：探討MGMT基因甲基化、DNMT1蛋白表達與胃癌的關(guān)系。方法：采用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測60例胃腺癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中MGMT基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，RT-PCR、免疫組化法分別檢測MGMT、DNMT1 mRNA和蛋白表達。結(jié)果：胃癌組織中MGMT基因啟動子區(qū)甲基化率明顯高于癌旁組織(45.0%對13.3%，P<0.001)。胃癌組織中MGMT mRNA陽性表達率顯著低于癌旁組織(41.7%對93.3%，P<0.001)，而DNMT1 mRNA陽性率明顯升高(76.7%對18.3%，P<0.001)。MGMT mRNA陰性表達的胃癌組織中其基因啟動子甲基化率較陽性表達者升高(57.1%對28.0%，P<0.05)。胃癌組織中MGMT蛋白表達與DNMT1蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.795，P<0.01)。結(jié)論：MGMT基因啟動子區(qū)高甲基化和DNMT1高表達可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。DNMT1可能調(diào)控MGMT基因的甲基化過程。

胃腫瘤； O(6)-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶； 甲基化； DNMT1

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是遺傳、環(huán)境等多種因素參與的復(fù)雜過程，涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳等方面，甲基化作為基因表觀遺傳學(xué)的一部分，受到越來越多的關(guān)注。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)在基因甲基化過程中起主要的維持甲基化狀態(tài)的作用[1]。6-氧-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是一種DNA修復(fù)酶，可修復(fù)烷化劑所致的DNA損傷，從而起抑制癌癥發(fā)生的作用[2]。有研究表明MGMT基因甲基化與結(jié)直腸癌[3]、非小細胞肺癌[4]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]有關(guān)。Yousuf等[6]發(fā)現(xiàn)MGMT基因高甲基化與胃癌的發(fā)生有關(guān)。但目前關(guān)于胃癌組織中MGMT基因甲基化狀態(tài)與DNMT1表達關(guān)系的研究少見。本實驗通過分析胃腺癌組織中MGMT基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)以及MGMT、DNMT1 mRNA和蛋白表達，旨在探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

材料與方法

一、組織來源

收集2015年1月—2016年7月青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院普外科切除的胃癌標本共60例(其中男35例，女25例，年齡39～73歲，中位年齡56歲)，經(jīng)組織學(xué)檢查證實為原發(fā)性胃腺癌，術(shù)前均未行放化療。胃癌組織取自癌灶中央非壞死區(qū)域，癌旁組織距癌組織5 cm以上，所有標本液氮速凍后-80 ℃保存。本研究方案經(jīng)青島大學(xué)臨床學(xué)院倫理委員會批準，研究對象均取得知情同意。

二、主要試劑

基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，DNA甲基化試劑盒(Zymo Research Corp)，RT-PCR反應(yīng)試劑盒、Trizol抽提試劑(日本TaKaRa公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

三、研究方法

1. 組織DNA的提取和甲基化修飾：取30 mg組織，提取基因組DNA。取DNA 800 ng，根據(jù)EZ DNA甲基化試劑盒說明書進行操作，修飾好的DNA洗脫后-20 ℃保存。

2. 引物設(shè)計：根據(jù)MGMT基因啟動子區(qū)CpG島序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計引物序列。甲基化引物上游：5’-TTT CGA CGT TCG TAG GTT TTC GC-3’；下游：5’-GCA CTC TTC CGA AAA CGA AAC G-3’；非甲基化引物上游：5’-TTT GTG TTT TGA TGT TTG TAG GTT TTT GT-3’，下游：5’-AAC TCC ACA CTC TTC CAA AAA CAA AACA-3’[7]。

3. MSP：反應(yīng)體系包含PCR混合液12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、2 μL修飾后的DNA，以滅菌雙蒸水補足至25 μL。反應(yīng)條件：97 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，57 ℃(甲基化引物)、55 ℃(非甲基化引物)退火60 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL產(chǎn)物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照射下觀察并分析。

4. RT-PCR法：Trizol抽提組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR反應(yīng)。MGMT上游引物：5’-GGA AGC TGC TGA AGG TTG TG-3’，下游：5’-GCT GCT GCA GAC CAC TCT GT-3’；DNMT1上游引物：5’-CGG TTC TTC CTC CTG GAG AAT GTC A-3’，下游：5’-CAC TGA TAG CCC ATG CGG ACC A-3’；以β-actin作為內(nèi)參，上游引物：5’-CTG CTC GCT TCG CTA CTT GCA-3’，下游：5’-CGG CAC CTG TCC TAC GAG TTG-3’；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，內(nèi)含SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye(×50)0.4 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 7 min。上ABI 7300 Real-time PCR儀實時檢測，采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果，將Ct值<30視為陽性表達。

5. 免疫組化染色：3% H2O2室溫孵育15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原熱修復(fù)。加入一抗(工作濃度1∶100)4 ℃室溫孵育12 h，PBS沖洗，加入二抗(濃度1∶100)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗。DAB染色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作為陰性對照，取已知陽性切片在同一條件下染色作為陽性對照。

結(jié)果判定：MGMT蛋白主要分布于細胞質(zhì)，少量表達于細胞核；DNMT1主要分布于胞核，少量表達于胞質(zhì)。隨機選取5個高倍視野觀察細胞染色情況。陽性細胞比例：0分，陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例≤5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>75%。染色強度：0分，未著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，褐色。以陽性細胞比例與染色強度之積作為染色總評分，評分為0～4分者視為陰性表達，5～12分為陽性表達。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，兩種蛋白表達的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

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結(jié) 果

一、胃癌組織中MGMT啟動子區(qū)甲基化情況

胃癌組織中MGMT基因啟動子區(qū)甲基化率為45.0%(27/60)，明顯高于癌旁組織(13.3%，8/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.56，P<0.001)(圖1)。

MP：甲基化陽性對照；ddH2O：陰性對照；N：癌旁組織；T：胃腺癌組織；M：甲基化條帶；U：非甲基化條帶

圖1 胃癌組織中MGMT基因甲基化狀態(tài)(MSP法)

二、胃癌組織中MGMT、DNMT1 mRNA表達

MGMT mRNA在胃癌組織中表達率為41.7%(25/60)，癌旁組織中為93.3%(56/60)，組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.51，P<0.001)；胃癌組織中DNMT1 mRNA表達率為76.7%(46/60)，明顯高于癌旁組織(18.3%，11/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=40.94，P<0.001)。MGMT mRNA陰性表達的胃癌組織DNMT1 mRNA陽性表達率(91.4%，32/35)明顯高于MGMT mRNA陽性表達者(56.0%，14/25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.23，P<0.05)。

三、胃癌組織中MGMT、DNMT1蛋白表達情況

MGMT蛋白主要表達于細胞質(zhì)，細胞核少量表達(圖2)，其在胃癌組織中的表達陽性率(40.0%，24/60)明顯低于癌旁組織(93.3%，56/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.40，P<0.001)。DNMT1主要表達于細胞核，細胞質(zhì)中少量表達(圖3)，其在胃癌組織中的表達陽性率(76.7%，46/60)明顯高于癌旁組織(6.7%，4/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=60.48，P<0.001)。

四、胃癌組織中MGMT基因甲基化與MGMT mRNA表達的關(guān)系

MGMT mRNA陰性表達的胃癌組織中MGMT基因啟動子區(qū)甲基化率(57.1%，20/35)顯著高于MGMT mRNA陽性表達的胃癌組織(28.0%，7/25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.96，P<0.05)。

五、胃癌組織中MGMT與DNMT1蛋白表達的相關(guān)性

胃癌組織中MGMT蛋白表達與DNMT1蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.795，P<0.01)。

圖2 MGMT在胃癌組織和癌旁組織中的表達(免疫組化染色，×400)

A：胃癌組織；B：癌旁組織

圖3 DNMT1在胃癌組織和癌旁組織中的表達(免疫組化染色，×400)

討 論

胃癌的全球發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第五位，死亡率更高居第三位，我國每年胃癌新發(fā)病例占全球新發(fā)病例的2/5以上[8]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多種復(fù)雜因素參與的過程，其中涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)等多種機制。DNA甲基化是指以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基供體，在DNMT的催化下，將其甲基轉(zhuǎn)移至氧胞嘧啶環(huán)的第5位碳原子從而形成甲基化脫氧胞嘧啶(5mC)的修飾作用[9]，抑癌基因CpG島甲基化可導(dǎo)致其沉默。烷化劑是一種在環(huán)境中普遍存在的致癌物質(zhì)，能使DNA鳥嘌呤的O6位發(fā)生烷基化，形成O6-甲基鳥嘌呤，導(dǎo)致胸腺嘌呤和鳥嘌呤錯配，從而改變基因的表觀遺傳性，引起癌癥的發(fā)生。

MGMT定位于染色體10q26，全長約170 kp[10]，可將烷化劑作用所形成的加合物從DNA上移除，使機體細胞免受烷化劑的損傷，起保持基因組完整性的作用。MGMT異常與腫瘤的發(fā)生和進展關(guān)系密切，大量研究顯示MGMT在多種腫瘤中的表達明顯降低，如膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、頭頸部腫瘤、非小細胞肺癌等[11]。本實驗采用MSP技術(shù)檢測胃癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中MGMT基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，同時應(yīng)用RT-PCR、免疫組化法分別檢測MGMT mRNA和蛋白表達，結(jié)果顯示胃癌組織中MGMT基因啟動子區(qū)甲基化率較相應(yīng)癌旁組織明顯升高，而MGMT mRNA、蛋白表達率較癌旁組織明顯降低，說明胃癌組織中MGMT蛋白表達降低可能與該基因啟動子區(qū)甲基化有關(guān)系。

目前有研究認為DNA啟動子區(qū)甲基化是部分可逆的，而DNA甲基化需DNMT的催化，DNMT包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等。有研究結(jié)果顯示DNMT1在多種癌組織中表達增高，如腎透明細胞癌[12]、前列腺癌[13]等。本實驗顯示DNMT1在胃癌組織中的表達率明顯高于癌旁組織，與本課題組之前的研究[14-15]結(jié)果相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，MGMT mRNA陰性表達的胃癌組織中MGMT基因甲基化率較MGMT mRNA陽性表達者升高。綜合以上結(jié)果，初步推測組織中DNMT1蛋白表達增高，使DNA修復(fù)酶MGMT基因發(fā)生高甲基化，表達缺失或減少，從而導(dǎo)致組織癌變。但具體調(diào)節(jié)機制還需大樣本實驗進一步證實。

總之，雖然數(shù)十年來惡性腫瘤檢測技術(shù)取得不斷突破，但胃癌的發(fā)病率和死亡率仍非常高。早期診斷和治療對提高胃癌患者的生活質(zhì)量和預(yù)后具有重要意義。本研究立足于表觀遺傳學(xué)水平，發(fā)現(xiàn)MGMT基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化和DNMT1高表達可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，DNMT1可能調(diào)控MGMT基因的甲基化過程，從而為胃癌的早期診治提供新思路。

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(2017-01-09收稿；2017-02-12修回)

Relationship between Methylation of MGMT Gene and Protein Expression of DNMT1 in Gastric Cancer

LIU Shanxiu, JIANG Xiangjun.

Department of Gastroenterology Ⅱ, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University Medical College, Qingdao, Shandong Province (266000)

JIANG Xiangjun, Email: drjxj@163.com

Stomach Neoplasms; O(6)-Methylguanine-DNA Methyltransferase; Methylation; DNMT1

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.07.005

*本文通信作者，Email: drjxj@163.com

Background: Studies have shown that promoter methylation of MGMT gene is closely related to many malignant tumor including gastric cancer. DNA methyltransferase 1 (DNMT1) is highly expressed in many malignant tumor tissues. However, studies on relationship between methylation of MGMT gene and DNMT1 expression in gastric cancer are rare. Aims: To investigate the relationship between methylation of MGMT gene, protein expression of DNMT1 and gastric cancer. Methods: Promoter methylation status of MGMT gene in 60 gastric adenocarcinoma tissues and corresponding paracancerous tissues were detected by methylation-specific PCR (MSP). RT-PCR and immunohistochemistry were used to measure mRNA and protein expressions of MGMT and DNMT1, respectively. Results: Methylation rate of MGMT gene promoter in gastric cancer was significantly higher than that in paracancerous tissue (45.0%vs. 13.3%,P<0.001). The positivity rate of MGMT mRNA in gastric cancer was significantly lower than that in paracancerous tissue (41.7%vs. 93.3%,P<0.001), while the positivity rate of DNMT1 mRNA expression in gastric cancer was significantly higher than that in paracancerous tissue (76.7%vs. 18.3%,P<0.001). Methylation rate of MGMT promoter in MGMT mRNA-negative expressed gastric cancer tissue was significantly higher than that in MGMT mRNA-positive expressed gastric cancer tissue (57.1%vs. 28.0%,P<0.05). It showed a negative correlation between MGMT protein expression and DNMT1 protein expression in gastric cancer tissue (r=-0.795,P<0.01). Conclusions: Promoter methylation of MGMT gene and high expression of DNMT1 may be associated with the development and progression of gastric cancer.