李 菁 于亞男 姜曉娜 路艷艷 楊 林 荊 雪 田字彬&

青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科1(266003) 海軍青島第一療養(yǎng)院2

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具核梭桿菌促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生及其機(jī)制研究*

李 菁1#于亞男1姜曉娜2路艷艷1楊 林1荊 雪1田字彬1&

青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科1(266003) 海軍青島第一療養(yǎng)院2

背景：越來(lái)越多的證據(jù)表明結(jié)直腸癌(CRC)與腸道菌群密切相關(guān)。近年研究顯示具核梭桿菌在CRC發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。目的：探討具核梭桿菌與CRC發(fā)生的相關(guān)性及其可能作用機(jī)制。方法：選用野生型C57BL/6小鼠和腸道多發(fā)性腺瘤APC(Min/+)小鼠，分別予具核梭桿菌菌液灌胃、皮下注射致癌劑1,2-二甲基肼二鹽酸鹽(DMH)或兩者聯(lián)合等不同處理，觀察結(jié)腸異常隱窩灶(ACF)(8周)或腫瘤(20周)生成情況。以Roche 454 GS FLX焦磷酸測(cè)序分析各組野生型C57BL/6小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，Bio-Plex ProTM技術(shù)檢測(cè)腸黏膜免疫因子表達(dá)。結(jié)果：與無(wú)具核梭桿菌定植的DMH處理組野生型C57BL/6小鼠或APC(Min/+)小鼠相比，具核梭桿菌定植小鼠結(jié)腸內(nèi)ACF或腫瘤數(shù)量顯著增多(P<0.05)。具核梭桿菌定植小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變明顯，表現(xiàn)為藍(lán)藻菌門含量減少，軟皮菌門、疣微菌門含量增加(P均<0.05)，腸黏膜腫瘤相關(guān)免疫因子IL-21、IL-22、IL-31、CD40L表達(dá)亦顯著增高(P<0.05)。結(jié)論：具核梭桿菌在腸道定植可促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生，其機(jī)制可能主要為引起腸道菌群失衡和調(diào)控腸黏膜腫瘤相關(guān)免疫因子表達(dá)。

結(jié)直腸腫瘤； 腸道菌群； 具核梭桿菌； 免疫，黏膜

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的發(fā)病率和死亡率在全球惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)中均居前列，近年我國(guó)發(fā)病率亦呈上升趨勢(shì)[1]。CRC發(fā)病受遺傳、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式、腸道穩(wěn)態(tài)、免疫功能以及腫瘤相關(guān)信號(hào)通路激活等多種因素影響，且越來(lái)越多的證據(jù)表明CRC與腸道菌群密切相關(guān)[2-5]，某些腸道共生菌可通過(guò)影響結(jié)直腸乃至整個(gè)消化系統(tǒng)的生理功能影響CRC發(fā)生[6-7]。

具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)是一種厭氧菌，分析顯示CRC患者腫瘤組織中的具核梭桿菌含量較正常組織顯著增加[8-9]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌在CRC的“腺瘤-腺癌”發(fā)生途徑中表現(xiàn)出逐步富集的趨勢(shì)，提示其在CRC發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用動(dòng)物模型探討具核梭桿菌與CRC發(fā)生的相關(guān)性，并嘗試探索其致CRC發(fā)生的可能作用機(jī)制，以期為更全面地了解具核梭桿菌在CRC發(fā)生、發(fā)展中的作用提供有力證據(jù)，同時(shí)為CRC的防治提供依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株、主要試劑和儀器

野生型C57BL/6小鼠60只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，雄性，4～5周齡，體質(zhì)量(18±2) g；APC(Min/+)小鼠30只(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)，雄性，4～5周齡，體質(zhì)量(18±2) g。所有小鼠均飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

具核梭桿菌ATCC 25586菌株[9]和非致病性大腸桿菌ATCC 47076菌株[11](美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，ATCC)。1,2-二甲基肼二鹽酸鹽(dimethyl-hydrazine, DMH)(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，糞便基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit, Omega Bio-tek Inc.)，Bio-Plex ProTM人細(xì)胞因子、趨化因 子和生長(zhǎng)因子磁性微球檢測(cè)試劑(Bio-Rad Laboratories, Inc.，可定量檢測(cè)來(lái)自多種基質(zhì)如血清、血漿、組織培養(yǎng)物上清液中53種分析物的水平)。

Roche 454測(cè)序系統(tǒng)(GS FLX Titanium System, Roche公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)菌培養(yǎng)：將具核梭桿菌ATCC 25586菌株培養(yǎng)于含氯化血紅素、K2HPO4、維生素K1、L-半胱氨酸鹽酸鹽的腦心浸液基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧工作站培養(yǎng)24 h[12]。非致病性大腸桿菌ATCC 47076菌株培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中[11]。兩種細(xì)菌培養(yǎng)后分別經(jīng)離心機(jī)分離，PBS懸浮備用。

2. 動(dòng)物分組和處理：60只野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。①對(duì)照組：PBS溶液灌胃，皮下注射 0.9% NaCl溶液；②DMH組：PBS溶液灌胃，皮下注射DMH制作結(jié)腸腫瘤模型(DMH可通過(guò)誘導(dǎo)DNA甲基化發(fā)揮強(qiáng)致癌作用)[13]；③具核梭桿菌組(Fn組)：具核梭桿菌菌液灌胃，皮下注射0.9% NaCl溶液；④Fn+DMH組：具核梭桿菌菌液灌胃，皮下注射DMH；⑤大腸桿菌組(Ec組)：大腸桿菌菌液灌胃，皮下注射0.9% NaCl溶液；⑥Ec+DMH組：大腸桿菌菌液灌胃，皮下注射DMH。

30只APC(Min/+)小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。①對(duì)照組：PBS溶液灌胃；②Fn組：具核梭桿菌菌液灌胃；③Ec組：大腸桿菌菌液灌胃。

PBS、具核梭桿菌菌液或大腸桿菌菌液灌胃劑量為每天0.1 mL(菌液中細(xì)菌計(jì)數(shù)為109CFU)，0.9% NaCl溶液、DMH皮下注射劑量為20 mg/kg，每周一次。上述處理持續(xù)8周以確保異常隱窩灶(aberrant crypt foci, ACF)形成，或持續(xù)20周以確保結(jié)腸腫瘤形成。觀察終點(diǎn)包括結(jié)腸ACF或腫瘤生成情況(亞甲藍(lán)染色和HE染色)、腸道菌群結(jié)構(gòu)變化和腸黏膜免疫因子表達(dá)。

3. 焦磷酸測(cè)序法超高通量基因組測(cè)序：每只小鼠取200 mg糞便，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取細(xì)菌總DNA。以指定區(qū)域V1-V3可變區(qū)設(shè)計(jì)、合成通用融合引物，行PCR擴(kuò)增，按儀器說(shuō)明書(shū)操作對(duì)擴(kuò)增所得DNA行Roche 454 GS FLX高通量測(cè)序[14-15]。細(xì)菌16S rRNA引物序列：27F 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’, 533R 5’-TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’。

應(yīng)用Mothur 1.14軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，質(zhì)量控制和特殊分類程序參照既往研究[2]。不同樣本間差異的分析采用Metastats分析和主成分分析(principal component analysis, PCA)。某一菌群的相對(duì)豐度以該菌群序列數(shù)占細(xì)菌總序列數(shù)的百分比表示。

4. 腸黏膜免疫因子檢測(cè)：以含PMSF(1∶100)、蛋白酶抑制劑混合物(1∶100)、磷酸酶抑制劑混合物(1∶100)的RIPA裂解液裂解小鼠結(jié)腸黏膜組織，使用 Bio-Plex ProTM磁性微球檢測(cè)試劑進(jìn)行免疫因子檢測(cè)[16]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、具核梭桿菌促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生

1. 野生型C57BL/6小鼠：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)8周時(shí)，對(duì)照組、Fn組和Ec組結(jié)腸未見(jiàn)明顯ACF生成，DMH組結(jié)腸黏膜中可見(jiàn)較多ACF，F(xiàn)n+DMH組ACF數(shù)量較DMH組和Ec+DMH組顯著增多(P<0.05)(圖1A)。

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)20周時(shí)，對(duì)照組、Fn組和Ec組未見(jiàn)明顯結(jié)腸腫瘤生成，DMH組可見(jiàn)結(jié)腸腫瘤，F(xiàn)n+DMH組結(jié)腸腫瘤數(shù)量較DMH組和Ec+DMH組顯著增多(P<0.05)(圖1B)。

2. APC(Min/+)小鼠：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)8周時(shí)，F(xiàn)n組結(jié)腸腫瘤數(shù)量較對(duì)照組和Ec組顯著增多(P<0.05)(圖1C)。

上述發(fā)現(xiàn)表明具核梭桿菌在腸道定植可促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生。

二、具核梭桿菌改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)

Roche 454 GS FLX焦磷酸測(cè)序和PCA分析顯示，6組野生型C57BL/6小鼠糞便菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，主成分PC1和PC2分別為19.67%和15.8%。Fn組和Fn+DMH組主成分均偏離PC2方向軸，而對(duì)照組、DMH組、Ec組、Ec+DMH組主成分均靠近PC2方向軸，有具核梭桿菌定植的小鼠糞便菌群主成分與無(wú)該菌定植者存在顯著差異(P<0.05)(圖2)，表明具核梭桿菌在腸道定植可改變腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖1 具核梭桿菌促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生

進(jìn)一步行細(xì)菌門水平的分析，結(jié)果證實(shí)僅Fn組和Fn+DMH組有梭桿菌門(Fusobacteria)定植；分析發(fā)現(xiàn)，各組間放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、厚壁菌門(Firmicutes)含量無(wú)明顯差異(P>0.05)，Ec組變形菌門(Proteobacteria)含量較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，F(xiàn)n+DMH組藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)含量較對(duì)照組顯著減少(P<0.05)，F(xiàn)n組、Fn+DMH組軟皮菌門(Tenericutes)、疣微菌門(Verruco-microbia)含量分別較對(duì)照組、DMH組顯著增加(P<0.05)(圖3)。

圖2 各組野生型C57BL/6小鼠糞便菌群PCA分析圖

三、具核梭桿菌促進(jìn)小鼠腸黏膜免疫因子分泌

各組野生型C57BL/6小鼠結(jié)腸黏膜Bio-PlexProTM檢測(cè)顯示，在白細(xì)胞介素-17F(IL-17F)、IL-21、IL-22、IL-23p19、IL-31、IL-33、CD40配體(CD40L)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(MIP3α)八種免疫因子中，F(xiàn)n組、Fn+DMH組IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23p19、IL-31、CD40L表達(dá)水平分別較對(duì)照組、DMH組顯著增高(P<0.05)，各組間IL-33、MIP3α表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖4)，表明具核梭桿菌在腸道定植可促進(jìn)腸黏膜免疫因子分泌。

討 論

在過(guò)去的30余年中，大量證據(jù)表明微生物感染尤其是病毒感染與人類癌癥發(fā)生之間存在密切聯(lián)系。Parkin[17]對(duì)2002年全球癌癥數(shù)據(jù)的分析顯示，感染相關(guān)癌癥例數(shù)為190萬(wàn)，占全球癌癥負(fù)荷的17.8%，主要病原體包括幽門螺桿菌、人乳頭狀瘤病毒、乙型和丙型肝炎病毒、EB病毒、HIV、人皰疹病毒以及血吸蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)等。盡管目前對(duì)CRC的病因尚不明確，但炎癥被公認(rèn)為是CRC的危險(xiǎn)因素之一。2012年，Castellarin等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，與配對(duì)正常組織相比，CRC組織中具核梭桿菌富集，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究通過(guò)野生型C57BL/6小鼠和腸道多發(fā)性腺瘤APC(Min/+)小鼠兩部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)， 驗(yàn)證了具核梭桿菌在小鼠腸道定植后可促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生。

人體腸道菌群對(duì)維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及腸道屏障、免疫和代謝功能至關(guān)重要，其與黏膜免疫系統(tǒng)共同決定腸道穩(wěn)態(tài)，并在某種程度上代表腸道內(nèi)環(huán)境[18-19]。免疫功能紊亂在腸道共生菌誘導(dǎo)炎癥和腫瘤發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮重要介導(dǎo)作用，腸道菌群結(jié)構(gòu)因某些因素發(fā)生改變即腸道微生態(tài)失衡時(shí)，其與免疫系統(tǒng)之間的正常聯(lián)系被打破，引起免疫功能紊亂，最終導(dǎo)致CRC發(fā)生、進(jìn)展[19-21]。具核梭桿菌致CRC發(fā)生的機(jī)制尚未明確，目前有以下幾種假說(shuō)：①通過(guò)增加條件致病菌、減少有益菌干擾腸道菌群平衡；②激活腫瘤相關(guān)信號(hào)通路；③誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)免疫因子如IL-21、IL-22、IL-31、CD40L等表達(dá)。研究顯示，IL-21可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖與腫瘤免疫監(jiān)視參與結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤發(fā)生[22]；CD40L則與機(jī)體對(duì)結(jié)腸癌的抗腫瘤免疫有關(guān)[23]；IL-22可能通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)CRC進(jìn)展[24]；IL-31對(duì)CRC細(xì)胞的增殖和移行具有調(diào)節(jié)作用[25]。

*與對(duì)照組比較，P<0.05；△與DMH組比較，P<0.05

與對(duì)照組比較，*P<0.05, **P<0.01；與DMH組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01

為進(jìn)一步探討具核梭桿菌促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生的機(jī)制，本研究對(duì)各組野生型C57BL/6小鼠的糞便細(xì)菌DNA行焦磷酸測(cè)序并作PCA分析，以明確其腸道菌群結(jié)構(gòu)。與人類相似，野生型C57BL/6小鼠的腸道菌群共分為952個(gè)運(yùn)算分類單位(operational taxonomic units, OUTs)，主要為擬桿菌門 、厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門、藍(lán)藻菌門、軟皮菌門以及未分類細(xì)菌。分析顯示，正常野生型C57BL/6小鼠腸道內(nèi)無(wú)梭桿菌門定植，予具核梭桿菌菌液灌胃處理后，該菌可在小鼠腸道定植，定植后的腸道菌群結(jié)構(gòu)與無(wú)該菌定植的小鼠存在顯著差異，表現(xiàn)為藍(lán)藻菌門含量減少，軟皮菌門、疣微菌門含量增加。上述發(fā)現(xiàn)表明具核梭桿菌定植可導(dǎo)致小鼠腸道菌群紊亂，進(jìn)而改變腸道微生態(tài)環(huán)境，可能促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生。

據(jù)報(bào)道，具核梭桿菌可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展[26]。本研究采用Bio-Plex ProTM技術(shù)檢測(cè)了各組野生型C57BL/6小鼠的腸黏膜免疫因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有具核梭桿菌定植的Fn組、Fn+DMH組小鼠腸黏膜免疫因子表達(dá)異常，表現(xiàn)為IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23p19、IL-31、CD40L表達(dá)增高，提示具核梭桿菌在小鼠腸道定植可促進(jìn)上述免疫因子分泌，調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫系統(tǒng)，從而可能進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路，參與結(jié)腸腫瘤發(fā)生。

綜上所述，具核梭桿菌在腸道定植可促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生，提示其可能在結(jié)直腸腺瘤-腺癌的演進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，作用機(jī)制可能主要為引起腸道菌群失衡和調(diào)控腸黏膜腫瘤相關(guān)免疫因子表達(dá)。后續(xù)擬進(jìn)一步開(kāi)展基于分子水平的研究，以揭示具核梭桿菌對(duì)特定細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65 (2): 87-108.

2 Chen HM, Yu YN, Wang JL, et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma[J]. Am J Clin Nutr, 2013, 97 (5): 1044-1052.

3 Wang T, Cai G, Qiu Y, et al. Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers[J]. ISME J, 2012, 6 (2): 320-329.

4 Zhu Q, Gao R, Wu W, et al. The role of gut microbiota in the pathogenesis of colorectal cancer[J]. Tumour Biol, 2013, 34 (3): 1285-1300.

5 Wu N, Yang X, Zhang R, et al. Dysbiosis signature of fecal microbiota in colorectal cancer patients[J]. Microb Ecol, 2013, 66 (2): 462-470.

6 Neish AS. Microbes in gastrointestinal health and disease[J]. Gastroenterology, 2009, 136 (1): 65-80.

7 Sonnenberg GF, Artis D. Innate lymphoid cell interactions with microbiota: implications for intestinal health and disease[J]. Immunity, 2012, 37 (4): 601-610.

8 Castellarin M, Warren RL, Freeman JD, et al.Fusobacteriumnucleatuminfection is prevalent in human colorectal carcinoma[J]. Genome Res, 2012, 22 (2): 299-306.

9 Flanagan L, Schmid J, Ebert M, et al.Fusobacteriumnucleatumassociates with stages of colorectal neoplasia development, colorectal cancer and disease outcome[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33 (8): 1381-1390.

10 Yu YN, Yu TC, Zhao HJ, et al. Berberine may rescueFusobacteriumnucleatum-induced colorectal tumorigenesis by modulating the tumor microenvironment[J]. Onco-target, 2015, 6 (31): 32013-32026.

11 Bonnet M, Buc E, Sauvanet P, et al. Colonization of the human gut byE.coliand colorectal cancer risk[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20 (4): 859-867.

12 Rhee KJ, Wu S, Wu X, et al. Induction of persistent colitis by a human commensal, enterotoxigenicBacteroidesfragilis, in wild-type C57BL/6 mice[J]. Infect Immun, 2009, 77 (4): 1708-1718.

13 Wang JL, Lin YW, Chen HM, et al. Calcium prevents tumorigenesis in a mouse model of colorectal cancer[J]. PLoS One, 2011, 6 (8): e22566.

14 Willing B, Halfvarson J, Dicksved J, et al. Twin studies reveal specific imbalances in the mucosa-associated microbiota of patients with ileal Crohn’s disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2009, 15 (5): 653-660.

15 Chen W, Liu F, Ling Z, et al. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer[J]. PLoS One, 2012, 7 (6): e39743.

16 de Jager W, te Velthuis H, Prakken BJ, et al. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2003, 10 (1): 133-139.

17 Parkin DM. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002[J]. Int J Cancer, 2006, 118 (12): 3030-3044.

18 B?ckhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, et al. Host-bacterial mutualism in the human intestine[J]. Science, 2005, 307 (5717): 1915-1920.

19 Round JL, Mazmanian SK. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease[J]. Nat Rev Immunol, 2009, 9 (5): 313-323.

20 Sobhani I, Tap J, Roudot-Thoraval F, et al. Microbial dysbiosis in colorectal cancer (CRC) patients[J]. PLoS One, 2011, 6 (1): e16393.

21 Vipperla K, O’Keefe SJ. The microbiota and its metabolites in colonic mucosal health and cancer risk[J]. Nutr Clin Pract, 2012, 27 (5): 624-635.

22 Jauch D, Martin M, Schiechl G, et al. Interleukin 21 controls tumour growth and tumour immunosurveillance in colitis-associated tumorigenesis in mice[J]. Gut, 2011, 60 (12): 1678-1686.

23 Büning C, Krüger K, Sieber T, et al. Increased expression of CD40 ligand on activated T cells of patients with colon cancer[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8 (4): 1147-1151.

24 Ernst M, Thiem S, Nguyen PM, et al. Epithelial gp130/Stat3 functions: an intestinal signaling node in health and disease[J]. Semin Immunol, 2014, 26 (1): 29-37.

25 Dambacher J, Beigel F, Seiderer J, et al. Interleukin 31 mediates MAP kinase and STAT1/3 activation in intestinal epithelial cells and its expression is upregulated in inflammatory bowel disease[J]. Gut, 2007, 56 (9): 1257-1265.

26 Kostic AD, Chun E, Robertson L, et al.Fusobacteriumnucleatumpotentiates intestinal tumorigenesis and modulates the tumor-immune microenvironment[J]. Cell Host Microbe, 2013, 14 (2): 207-215.

(2017-01-19收稿；2017-03-24修回)

FusobacteriumnucleatumPrompts Colonic Tumorigenesis in Mice and its Potential Mechanism

LI Jing1, YU Yanan1, JIANG Xiaona2, LU Yanyan1, YANG Lin1, JING Xue1, TIAN Zibin1.

1Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao, Shandong Province (266003);2Qingdao First Sanatorium of Navy, Qingdao, Shandong Province

tianzb@qdumh.qd.sd.cn

Colorectal Neoplasms; Gut Microbiota;Fusobacteriumnucleatum; Immunity, Mucosal

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.07.003

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81502025)，山東省自然科學(xué)基金培養(yǎng)基金項(xiàng)目(ZR2015PH011)，國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81572320)

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&本文通信作者，Email: tianzb@qdumh.qd.sd.cn

Background: Accumulating evidence links colorectal cancer (CRC) with the gut microbiota.Fusobacteriumnucleatum(F.nucleatum) has been revealed to be involved in the development of CRC, however, the mechanism ofF.nucleatumin mediating colorectal tumorigenesis is still poorly understood. Aims: To investigate the effect and potential mechanism ofF.nucleatumon CRC. Methods: Wild type C57BL/6 mice and APC(Min/+) mice characterized by multiple intestinal neoplasia were used in this animal study. After administered withF.nucleatumintragastrically and/or 1,2-dimethylhydrazine (DMH, a carcinogen) subcutaneously, the aberrant crypt foci (ACF) and colonic tumor were counted at 8th and 20th week, respectively. Structural alteration of intestinal microbiota and mucosal immune factors were detected in wild type C57BL/6 mice receiving different interventions by using Roche 454 GS FLX pyrosequencing and Bio-Plex ProTMcytokine assay, respectively. Results: In DMH-treated wild type C57BL/6 mice or APC(Min/+) mice, number of ACF and colonic tumor in those administered withF.nucleatumwere significantly higher than those without (P<0.05).F.nucleatumcolonization significantly altered the lumen microbial structure, with decreasedCyanobacteriumand increasedTenericutesandVerrucomicrobia(Pall <0.05). Furthermore,F.nucleatumup-regulated expressions of tumor-related immune factors in colonic mucosa, such as IL-21, IL-22, IL-31 and CD40L (P<0.05). Conclusions:F.nucleatumcolonization in intestine may prompt colonic tumorigenesis in mice via inducing intestinal dysbiosis and modulating tumor-related immune factors expression.