孫建華,馬愛軍,崔文曉,王廣寧,孫志賓,王新安,孟雪松,劉圣聰,張 濤

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室,山東青島266071;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室,山東青島266071;4.大連天正實業(yè)有限公司,遼寧大連116000)

利用微衛(wèi)星標記技術(shù)對紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)家系系譜認證的研究

孫建華1,2,3,馬愛軍2,3,崔文曉1,2,3,王廣寧2,3,孫志賓2,3,王新安2,3,孟雪松4,劉圣聰4,張 濤4

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室,山東青島266071;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室,山東青島266071;4.大連天正實業(yè)有限公司,遼寧大連116000)

紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)是我國北方地區(qū)的一種經(jīng)濟型海水魚類,但目前對其群體遺傳多樣性和系譜信息研究成果較少。本文研究了目前紅鰭東方鲀養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性情況和系譜信息,為其提供遺傳改良的理論基礎(chǔ)。從2015年所建的12個紅鰭東方鲀家系中隨機選取5個家系,采用8個微衛(wèi)星標記對其遺傳多樣性進行分析和系譜認證。8個位點共檢測得到32個等位基因,每個位點等位基因數(shù)為3～6個,平均值為4個。平均觀測雜合度(A)范圍為0.453 3～0.953 3,平均期望雜合度(He)范圍為0.490 8～0.790 1,平均多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.455 5～0.754 6。不同位點共發(fā)現(xiàn)8個特異性等位基因,7#家系發(fā)現(xiàn)3個,3#和11#家系各發(fā)現(xiàn)2個,12#家系發(fā)現(xiàn)1個,10#家系未發(fā)現(xiàn)特異性等位基因。根據(jù)子代基因型成功推斷出5個家系的親本基因型,據(jù)此鑒別各個家系。在fms15位點,可將3#和11#家系與其他家系相區(qū)別;TOG01位點可將7#家系與其他家系相區(qū)別; f1497位點可將12#家系相區(qū)別。因此,fms15,TOG01,f1497這3個標記可以作為鑒別5個家系的特異性標記。結(jié)果說明,所選的8個微衛(wèi)星標記在這5個家系中多態(tài)信息含量較高,且在已選用的8個微衛(wèi)星標記中,最少用3個標記可鑒別5個紅鰭東方鲀家系。綜合分析表明微衛(wèi)星標記能有效地為紅鰭東方鲀?nèi)后w的系譜分析提供技術(shù)支持,為今后紅鰭東方鲀開展分子標記輔助育種提供了可靠的理論依據(jù)。

紅鰭東方鲀;微衛(wèi)星;遺傳多樣性;系譜認證

系譜認證作為一種有效的水產(chǎn)動物遺傳育種技術(shù),廣泛應(yīng)用于魚類[1-8]、甲殼類[9-13]和貝類[14-17]。系譜認證可在選育過程中衡量家系間的遺傳參數(shù),分析家系信息,指導(dǎo)親本的篩選,避免因近親繁殖而導(dǎo)致種質(zhì)衰退。特別是在混養(yǎng)條件下,可快速有效地區(qū)分各個家系,保持各家系的遺傳信息,作進一步地選育工作。為充分有效地利用選育群體,則需找到一種標記可快速準確地鑒別出不同家系。目前水產(chǎn)動物育種采用的標記方法大體分為外掛式標記和體內(nèi)標記[18],外掛式標記主要以剪鰭和顏色標記為主,以此方法標記魚體,在一定程度上對魚體有損傷,且對魚的生長有負面影響。體內(nèi)標記主要為被動整合雷達標記、熒光標記和染料標記等,這種方法對魚體規(guī)格有一定要求,且隨著魚體增長,標記有可能出現(xiàn)缺失現(xiàn)象,影響后期觀察。隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的發(fā)展,分子標記有分辨率高、準確度高、識別快等優(yōu)點,在家系選育過程中發(fā)揮著重要的作用,微衛(wèi)星標記作為分子標記的一種,被廣泛應(yīng)用于家系的鑒別之中。微衛(wèi)星標記是一種共顯性標記,其具有多態(tài)信息含量豐富、保守性高、通用性好、分布廣等特點,作為輔助分子育種手段廣泛應(yīng)用于群體多樣性分析,系譜認證等方面,利用微衛(wèi)星標記技術(shù)對家系進行系譜分析,可有效地評估各家系的遺傳參數(shù),掌握家系信息,在種質(zhì)資源保護[19]、生態(tài)修復(fù)和提高育種效率[20]上被廣泛應(yīng)用,并取得一定成效。

(王佳實 編輯)

紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes),隸屬于鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方鲀屬(Takifugu),是暖溫性、廣鹽性底棲肉食性魚類。主要分布地區(qū)為朝鮮半島、日本和中國沿海地區(qū)[21]。其口感鮮美,肉質(zhì)細嫩,營養(yǎng)豐富,有較高的經(jīng)濟價值,在我國北方已經(jīng)形成一定的養(yǎng)殖規(guī)模,產(chǎn)品主要出口日本、韓國。選擇育種作為培育優(yōu)良經(jīng)濟性狀的手段之一,在選育前要構(gòu)建遺傳信息豐富的群體,群體的遺傳多樣性決定了遺傳信息含量的豐富性,劉永新等[22]利用微衛(wèi)星標記輔助構(gòu)建紅鰭東方鲀家系,通過34對微衛(wèi)星引物對紅鰭東方鲀兩個群體進行遺傳評估,從而制定育種計劃。

國內(nèi)的選育方式主要以群體選育為主,但經(jīng)選育的后代個體之間親緣關(guān)系模糊,遺傳信息不明確,有可能在進一步的繁育過程中出現(xiàn)近交的現(xiàn)象,造成紅鰭東方鲀種質(zhì)資源退化,遺傳多樣性降低,養(yǎng)殖群體成活率下降等現(xiàn)象[23]。為提高種質(zhì)品質(zhì),保持選育群體較高的遺傳多樣性,作者認為有必要在選育前期對親魚進行系譜認證,掌握群體選育的家系背景和遺傳信息,使親魚保持較高水平的遺傳距離,避免近親繁殖,本研究以微衛(wèi)星標記作為鑒別家系的方法為目的,展開以下研究。

1 材料與方法

1.1 樣品選取

實驗所用的紅鰭東方鲀樣品均于2015年取自大連天正實業(yè)有限公司,為當(dāng)年4月所建的12個全同胞家系,挑選親魚為體格健壯、無外傷、色澤好、活力強、腹部性腺輪廓明顯的3齡雌雄魚12對,各家系編號分池飼養(yǎng),編號從1到12為1#家系到12#家系,從中隨機選取5個家系,分別為3#家系,7#家系,10#家系, 11#家系,12#家系,體重范圍在80～120 g,體長范圍在13～16 cm,各家系選完整健康的魚取樣30尾,共計150尾,取其尾鰭置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物與試劑

參照Ma等[24]、鄒杰等[25],Segawa[26]、郝君等[27]和Kai等[28]使用引物序列共計35對,由上海生工生物科技有限公司合成。微衛(wèi)星引物序列、片段長度等詳情見表1?；蚪MDNA提取試劑盒、d NTP、taq酶、胰RNA酶等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 基因組DNA的提取

實驗所用紅鰭東方鲀基因組DNA是用天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取,提取方法參照使用說明書,之后用瓊脂糖凝膠檢測目的條帶完整性,再用NANO DPOP1000分光光度計測量DNA純度和濃度,最后將符合條件的個體DNA稀釋至40 ng/μL,置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR反應(yīng)及電泳

PCR擴增總體系15μL:Taq酶0.2μL(5 U/μL),d NTP 1.3μL(2.5 mmo L/μL),buffer 1.5μL,上下游引物各0.6μL(10μmo L),模板1μL(50 ng/μL),補充H2O 9.8μL。PCR擴增反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,退火30 s(各引物的退火溫度見表1),72℃復(fù)性30 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。對PCR擴增產(chǎn)物進行8%SDS-PAGE電泳,用硝酸銀染色檢測產(chǎn)物條帶,篩選得到目的條帶。

表1 35對微衛(wèi)星引物信息及在本實驗中的退火溫度Table 1 Information and specific annealing temperatures of 35 pairs of microsatellite marker primers used in this study

續(xù)表

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)每個個體的條帶位置確定基因型,按照從大到小的順序?qū)Φ任换蚍肿恿看笮∵M行排序,把各位點后兩位的數(shù)字放在最前面,例如011表示TOG01位點分子量最大的等位基因1。用Popgene32軟件處理數(shù)據(jù),計算各微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ne),平均觀察雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He),并計算5個家系Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)(d)、平衡檢驗概率值(P)、遺傳相似性系數(shù)(I)和遺傳距離(D)。根據(jù)Botstein等[29]的方法,計算多態(tài)信息含量(PIC)。采用MEGA4.1軟件根據(jù)遺傳距離進行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 遺傳多樣性分析

隨機抽取30個個體,對35個微衛(wèi)星標記進行多態(tài)性篩選(圖略),得到8個多態(tài)性好的微衛(wèi)星標記,分別為f362,f1497,f1637,fms15,fms89,f169,f1372和TOG01。將8個微衛(wèi)星標記的數(shù)據(jù)用Popgene32軟件分析,數(shù)據(jù)內(nèi)容見表2。分析結(jié)果表明,8個微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量在0.455 5～0.754 6,平均多態(tài)信息含量為0.597 3,具有較為豐富的多態(tài)性。150個樣本數(shù)(N)經(jīng)8個微衛(wèi)星位點檢驗共得到32個等位基因,各位點的等位基因數(shù)在3～6個,等位基因出現(xiàn)的最高頻率(S)在0.266 7～0.690 0,每個微衛(wèi)星座位平均含4個等位基因;觀測雜合度在0.453 3～0.953 3,平均觀測雜合度為0.709 2;期望雜合度在0.490 8～0.790 1,平均期望雜合度為0.655 6。對8個微衛(wèi)星位點進行哈迪溫伯格平衡(HWE)檢測,結(jié)果顯示,f1497位點符合哈迪溫伯格平衡,其余7個微衛(wèi)星位點都極顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P＜0.001)。8個微衛(wèi)星位點在5個紅鰭東方鲀家系中的遺傳分化指數(shù)(Fst)均大于0。

表2 8個微衛(wèi)星位點在紅鰭東方鲀?nèi)后w中的遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Genetic diversity parameters of 8 microsatellite loci among cultured Takifugu rubripes populations

根據(jù)所得遺傳距離,經(jīng)MEGA4.1軟件聚類分析,得到5個紅鰭東方鲀家系之間的遺傳距離和相似性指數(shù)(表3),并構(gòu)建UPGMA(圖1)。從結(jié)果可知,3#家系和12#家系之間的遺傳距離最小,相似性最高,聚合在一起,然后與7#家系聚合在一起,最后再與10#家系和11#家系聚合在一起。

表3 紅鰭東方鲀5個家系的遺傳距離和相似指數(shù)Table 3 Genetic similarity index and distance in 5 Takifugu rubripes families

圖1 紅鰭東方鲀5個家系的UPGMA圖Fig.1 UPGMA dendrogram among 5 Takifugu rubripes families

2.2 家系特異性鑒別

用8個微衛(wèi)星位點在5個紅鰭東方鲀家系中檢測,共計得到32個等位基因。每個位點的等位基因數(shù)為3～6個。fms89位點有6個等位基因;fms15位點有5個等位基因;TOG01,f362和f1372位點有4個等位基因;f1497,f169和f1637位點有3個等位基因。5個家系中檢測到8個家系特異性等位基因,在3#家系和11#家系中各檢測到2個,在12#家系中檢測到1個,在7#家系中檢測到3個,在10#家系中沒有未發(fā)現(xiàn)家系特異性等位基因。fms15位點的特異性基因a(圖2)可用于鑒別3#家系與其他4個家系;TOG01位點的特異性基因b(圖3)可用于鑒別7#家系與其他4個家系;fms15位點的特異性基因c(圖4)可用于鑒別11#家系與其他4個家系;f1497位點的特異性基因d(圖5)可用于鑒別12#家系與其他4個家系。因此,fms15, TOG01和f1497位點可作為區(qū)分5個家系的特異性標記。

圖2 3#家系在fms15位點的微衛(wèi)星DNA擴增圖譜Fig.2 Demonstration of microsatellite loci amplified by fms15 primer pairs in 3#family

圖3 7#家系在TOG01位點的微衛(wèi)星DNA擴增圖譜Fig.3 Demonstration of microsatellite loci amplified by TOG01 primer pairs in 7#family

圖4 11#家系在fms15位點的微衛(wèi)星DNA擴增圖譜Fig.4 Demonstration of microsatellite loci amplified by fms15 primer pairs in 11#family

圖5 12#家系在f1497位點的微衛(wèi)星DNA擴增圖譜Fig.5 Demonstration of microsatellite loci amplified by f1497 primer pairs in 12#family

2.3 推斷缺失親本基因型

微衛(wèi)星標記屬于共顯性分子標記,嚴格遵循孟德爾遺傳定律,子代的等位基因一半來自母本,一半來自父本,因此可根據(jù)子代的等位基因來推測缺失親本的基因型。每個家系的等位基因信息列于表4。在TOG01位點,7#家系有4種基因型(圖3),分別為014/014,013/014,011/013和011/014,基因型中存在014/014,由此推測其父母本的基因型中各包含有等位基因014,又因為基因型中存在013/014和011/014,推測得知其親本基因型為(011/014)×(013/014)。運用同樣的方法可推斷出5個家系在其他位點的親本基因型,具體信息見表4。

表4 各家系觀察到和推斷出的基因型Table 4 Observed and conferred genotypes of each family

續(xù)表

3 討 論

明確家系系譜之間的關(guān)系是家系選育的前提,通過家系選育可提高有利基因在某一群體內(nèi)出現(xiàn)的頻率,降低育種不需要的基因頻率,建立正確的系譜,掌握育種群體的系譜信息。傳統(tǒng)的外部物理標記如顏色、電子標記等有明顯的不足之處[10],與其相比,微衛(wèi)星標記的優(yōu)點有多態(tài)性高、遵循孟德爾分離定律、共顯性遺傳等特點,已成為多種水產(chǎn)動物系譜分析的重要工具[30]。

目前已有微衛(wèi)星標記應(yīng)用于海洋生物家系系譜認證的報道,董世瑞等[31]根據(jù)子代基因型成功地推斷出4個中國明對蝦(Penaeus orientalis)家系的父本基因型,通過基因型找到父母本,鑒別出4個家系;劉磊等[32]根據(jù)已知的親本基因型和子代基因型,推斷出6個三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)家系全部親本基因型,鑒別了各個家系;杜曉東等[33]根據(jù)子代基因型,推斷出4個馬氏珠母貝(Pinctada martensi)家系的親本基因型,以此鑒別不同家系;于飛等[2]根據(jù)已知親本基因型和子代基因型,推斷出7個大菱鲆(Scophthalmus maximus)家系中缺失的其他親本基因型,以此鑒別各個家系;馬群群[34]根據(jù)已知子代基因型和母本基因型,推斷出4個擬穴青蟹(Scylla Paramamosain)家系中缺失的其他親本基因型,以此鑒別各個家系。紅鰭東方鲀的家系鑒別尚未報道,本研究應(yīng)用8個微衛(wèi)星標記,推斷出5個紅鰭東方鲀家系缺失的親本基因型,其中僅用3個微衛(wèi)星標記fms15,TOG01和f1497便可鑒別出5個家系。

種群進化和遺傳改良離不開物種的遺傳多樣性,遺傳多樣性豐富的物種,具有更大的遺傳進展的空間[35]。目前,已有相關(guān)報道通過利用微衛(wèi)星標記手段對紅鰭東方鲀親本進行選配,萬玉美等[36]利用21個微衛(wèi)星標記對從日本引進的紅鰭東方鲀?nèi)后w和在秦皇島經(jīng)過群體選育的島紅鰭東方鲀?nèi)后w進行遺傳參數(shù)的評估。其中從日本引進的紅鰭東方鲀?nèi)后w的平均觀測雜合度(Ho)為0.657 2,平均期望雜合度(He)為0.651 6,選育的秦皇島紅鰭東方鲀?nèi)后w的平均觀測雜合度(Ho)為0.523 9,平均期望雜合度(He)為0.607 3。本實驗的5個紅鰭東方鲀家系的平均觀測雜合度(Ho)為0.709 2,平均期望雜合度(He)為0.655 6。雜合度是評估群體遺傳多樣性的重要指標,雜合度越高,群體的遺傳多樣性就越高[37],與上述實驗結(jié)果相比較,本實驗的紅鰭東方鲀家系的遺傳多樣性較高,這表明家系內(nèi)含有豐富的遺傳信息,適應(yīng)環(huán)境變化能力強,是進行選育的良好群體。

本研究結(jié)果表明,多態(tài)信息含量(PIC)在8個微衛(wèi)星位點上分別為TOG01位點0.701 0,f1497位點0.507 7,f169位點0.511 9,fms89位點0.754 6,fms15位點0.455 5,f362位點0.631 2,f1637位點0.547 0, f1372位點0.669 2。根據(jù)相應(yīng)的評價標準:當(dāng)PIC＜0.25時,此位點為低度多態(tài)性位點;當(dāng)0.25＜PIC＜0.50時,此位點為中度多態(tài)性位點;當(dāng)PIC＞0.50時,此位點為高度多態(tài)位點[32]。本研究僅fms15位點多態(tài)信息含量為0.455 5,為中度多態(tài)位點,其余7個位點的多態(tài)信息含量都比0.5大,為高度多態(tài)位點。由此可知,本研究所用的8個微衛(wèi)星標記在5個紅鰭東方鲀家系中具有較高的多態(tài)信息含量,說明這5個群體內(nèi)的遺傳變異大,有著相對較高的遺傳多樣水平。除f1497位點外,其他7個位點在5個紅鰭東方鲀家系中的數(shù)據(jù)表明,7個位點都顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因:1)由于樣本數(shù)較多,取樣時有少數(shù)混養(yǎng)造成誤差;2)人為讀取基因型時判斷錯誤,導(dǎo)致出現(xiàn)無效等位基因;3)某些雜合過剩的位點突變,導(dǎo)致產(chǎn)生不同的等位基因。以上原因需要進一步研究解決,以免對實驗結(jié)果帶來影響。

通過對5個紅鰭東方鲀家系進行系譜分析,發(fā)現(xiàn)了8個家系特異性等位基因,但這8個家系特異性等位基因是否單獨屬于某個家系,還需要用大量的樣本進行研究。本文用8個微衛(wèi)星位點中的fms15,TOG01, f1497三個微衛(wèi)星位點即可區(qū)分出5個紅鰭東方鲀家系。這充分證明了微衛(wèi)星標記可作為追蹤系譜的有效工具,通過特異性標記來區(qū)分不同家系,為家系選育提供科學(xué)的理論參考依據(jù)。

[1] FROST L A,EVANS B S,JERRY D R.Loss of genetic diversity due to hatchery culture practices in barramundi(Lates calcarifer)[J]. Aquaculture,2006,261(3):1056-1064.

[2] YU F,WANG W J,KONG J,et al.The application of microsatellite markers for genealogical identification in selective breeding program of turbot(Scophthal musmaximus L.)[J].Haiyang Xuebao,2009,31(3):127-136.于飛,王偉繼,孔杰,等.微衛(wèi)星標記在大菱鲆(Scophthal musmaximus L.)家系系譜印證中的應(yīng)用研究[J].海洋學(xué)報,2009,31(3):127-136.

[3] MCDONALD G J,DANZMANN R G,FERGUSON M M.Relatedness determination in the absence of pedigree information in three cul-tured strains of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Aquaculture,2004,233(1):65-78.

[4] MIAO G D.Development of SSR Markers and construction of genetic linkage maps of half-smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis) [D].Qingdao:Ocean University of China,2010.苗貴東.半滑舌鰨微衛(wèi)星標記開發(fā)、應(yīng)用及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[D].青島:中國海洋大學(xué),2010.

[5] JEONG D S,GONZALEZ E B,MORISHIMA K,et al.Parentage assignment of stocked black sea bream Acanthopagrus schlegelii in Hiroshima Bay using microsatellite DNA markers[J].Fisheries Science,2007,73(4):823-830.

[6] NAVARRO A,BADILLA R,ZAMORANO M J,et al.Development of two new microsatellite multiplex PCRs for three sparid species: Gilthead seabream(Sparus auratus L.),red porgy(Pagrus pagrus L.)and redbandedseabream(P.auriga,Valenciennes,1843)and their application to paternity studies[J].Aquaculture,2008,285(1):30-37.

[7] LOU J F,LEI S Y,ZHU J L,et al.AFLP analysis of genetic diversity in two cultured communities of Pseudosciaena crocea[J].Advances in Marine Science,2015,33(3):361-366.婁劍鋒,雷世勇,竺俊全,等.岱衢洋與官井洋大黃魚養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的AFLP分析[J].海洋科學(xué)進展,2015,33(3):361-366.

[8] SEKINO M,SUGAYA T,HARA M,et al.Relatedness inferred from microsatellite genotypes as a tool for broodstock management of Japanese flounder Paralichthys olivaceus[J].Aquaculture,2004,233(1):163-172.

[9] LI Y,WONGPRASERT K,SHEKHAR M,et al.Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two populations[J].Aquaculture,2007,266(1):279-288.

[10] JERRY D R,PRESTON N P,CROCOS P J,et al.Parentage determination of Kuruma shrimp Penaeus(Marsupenaeus)japonicus using microsatellite markers(Bate)[J].Aquaculture,2004,235(1):237-247.

[11] CUI H Y,MA H Y,MA C Y,et al.Genetic diversity among different families of mud crab Scylla paramamosain by microsatellite markers[J].Marine Fisheries,2011,33(3):274-281.崔海玉,馬洪雨,馬春艷,等.利用微衛(wèi)星標記比較分析擬穴青蟹不同家系的遺傳多樣性[J].海洋漁業(yè),2011,33(3):274-281.

[12] MA C Y,MA H Y,MA L B,et al.Microsatellite analysis on genetic variation of imported Litopenaeus vannamei population and cultured stocks[J].Marine Fisheries,2011,33(1):1-8.馬春艷,馬洪雨,馬凌波,等.凡納濱對蝦引進群體和2個養(yǎng)殖群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J].海洋漁業(yè),2011,33(1):1-8.

[13] LIU L,LI J,LIU P,et al.Applicability of microsatellite DNA markers in parentage determination of Portunus trituberculatus[J].Progress in Fishery Sciences,2010,31(5):76-82.劉磊,李健,劉萍,等.微衛(wèi)星DNA標記用于三疣梭子蟹家系親子關(guān)系的鑒定[J].漁業(yè)科學(xué)進展,2010,31(5):76-82.

[14] ZHANG H B,LIU X,ZHANG G F,et al.Effects of effective population size on the Fl growth and survival of bay scallop Argopecten irradians[J].Haiyang Xuebao,2005,27(2):177-180.張海濱,劉曉,張國范,等.不同有效繁殖群體數(shù)對海灣扇貝F1生長和存活的影響[J].海洋學(xué)報,2005,27(2):177-180.

[15] LI Z B.Multiplex PCR application in microsatellite of Haliotis rubra[J].Oceanologia et Limnologia Sinica,2005,36(4):319-325.黎中寶.多元PCR在黑鮑(Haliotis rubra)微衛(wèi)星遺傳研究中的應(yīng)用[J].海洋與湖沼,2005,36(4):319-325.

[16] PORTA J,PORTA J M,MARTíNEZ-RODRíGUEZ G,et al.Development of a microsatellite multiplex PCR for Senegalese sole(Solea senegalensis)and its application to broodstockmanagement[J].Aquaculture,2006,256(1):159-166.

[17] CHENG P,YANG A G,WU B,et al.The applicability analysis on microsatellite markers for parentage determination of different shell color lines of Japanese scallop(Patinopecten yessoensis)[J].Acta Hydrobiologica Sinica,2011,35(5):768-775.程鵬,楊愛國,吳彪,等.微衛(wèi)星標記在不同殼色蝦夷扇貝家系親權(quán)鑒定的適用性[J].水生生物學(xué)報,2011,35(5):768-775.

[18] LI X J,HU C,WANG L,Current research progress of fish family selective breeding[J].Fisheries Science,2016,35(1):81-86.李學(xué)軍,胡燦燦,王磊,等.魚類家系選育的研究進展[J].水產(chǎn)科學(xué),2016,35(1):81-86.

[19] HU J,HOU X Y,YIN S W,et al.Genetic diversity of different geographical populations of Cheilinus undulatus revealed by microsatellite analysis[J].Advances in Marine Science,2013,31(4):538-545.胡靜,侯新遠,尹紹武,等.波紋唇魚(Cheillinus undulatus)不同地理種群遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析[J].海洋科學(xué)進展,2013,31(4):538-545.

[20] ZHANG B,SONG W P.Recent progresses on microsatellite multiplex PCRs for parentage analysis of aquatic animals[J].Marine Fisheries,2012,34(3):350-356.張博,宋文平.微衛(wèi)星多重PCR在水生動物親權(quán)分析中的研究進展[J].海洋漁業(yè),34(3):350-356.

[21] WANG K Q,CHEN M,GAO T X.Study on taxonomy and fauna of Takifugu[J].Journal of Ocean University of Qingdao(Natural Science),2001,31(6):855-860.王奎旗,陳梅,高天翔.東方鲀屬魚類的分類與區(qū)系分布研究[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2001,31(6):855-860.

[22] LIU Y X,LIU Y,ZHOU Q,et al.Application of microsatellite markers in parental apolegamy of redfin puffer Takifugu rubripes[J]. Journal of Dalian Ocean University,2015,30(2):113-119.劉永新,劉奕,周勤,等.利用微衛(wèi)星標記指導(dǎo)紅鰭東方鲀親本選配[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2015,30(2):113-119.

[23] HE X Y,BAI J J,LIU X L,et al.Application of microsatellite makers for parentage determination in Micropterus salmoides[J].Journal of Northwest A&F University(Natural Science Edition),2009(8):55-62.何小燕,白俊杰,劉小林,等.微衛(wèi)星DNA標記在大口黑鱸親權(quán)鑒定中的應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2009(8):55-62.

[24] MA H Y,CHEN S L,LIAO X L,et al.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from a dinucleotide-enriched genomic library of obscure puffer(Takifugu obscurus)and cross-species amplification[J].Conserv Genet,2009,10(4):955-957.

[25] ZOU J,MA A J,ZHAO Y F,et al.Study on the genetic structure of three cultured populations of Takifugu obscurus with microsatellite markers[J].Progress in Fishery Sciences,2015,36(2):55-62.鄒杰,馬愛軍,趙艷飛,等.利用微衛(wèi)星標記分析3個暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性[J].漁業(yè)科學(xué)進展,2015,36(2):55-62.

[26] SEGAWA S.Takifugu obscurus'studies in high growth genetic and molecular biology[D].Tokyo:Tokyo University,2009.

[27] HAO J,SUN X W,MENG X S.Analyzing the polymorphisms of Takifugu rubripes with microsatellite[J].Journal of Shanghai Fisheries University,2006,15(1):21-24.郝君,孫效文,孟雪松.紅鰭東方鲀微衛(wèi)星DNA多態(tài)性初步分析[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報,2006, 15(1):21-24.

[28] KAI W,KIKUCHI K,TOHARI S,et al.Integration of the genetic map and genome assembly of fugu facilitates insights into distinct features of genome evolution in teleosts and mammals[J].Genme Biology&Evolution,2011,3(3):424-442.

[29] BOTSTEIN D,WHITE R L,SKOLNICK M,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].American Journal of Human Genetics,1980,32(3):314-331.

[30] SUN N,LI Q,YU H,et al.Parentage determination of Scapharca broughtonii based on microsatellite analysis[J].Periodical of Ocean University of China,2015(9):42-48.孫楠,李琪,于紅,等.利用微衛(wèi)星標記的魁蚶混交家系鑒定[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015(9):42-48.

[31] DONG S R,KONG J,ZHANG Q W,et al.Pedigree tracing of Fenneropenaeus chinensis by microsatellite DNA markers genotyping [J].Haiyang Xuebao,2006,28(5):157-161.董世瑞,孔杰,張慶文,等.微衛(wèi)星分型方法進行中國明對蝦家系系譜鑒定[J].海洋學(xué)報,2006,28(5):157-161.

[32] LIU L,LI J,LIU P.Parentage determination of Portunus trituberculatus in family establishment based on microsatellite DNA markers [J].Periodical of Ocean University of China,2012,42(7-8):38-44.劉磊,李健,劉萍.基于微衛(wèi)星標記的三疣梭子蟹家系系譜認證[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,42(7-8):38-44.

[33] DU X D,GAO Y Z,DENG Y W,et al.Genetic structure and genealogical identification of four families of pearl oyster Pinctada martensii,as inferred by microsatellite markers[J].Journal of Fisheries of China,2011,35(12):1795-1804.杜曉東,高遠鎮(zhèn),鄧岳文,等.利用微衛(wèi)星標記進行馬氏珠母貝家系遺傳結(jié)構(gòu)分析與系譜認證[J].水產(chǎn)學(xué)報,2011,35(12):1795-1804.

[34] MA Q Q.Development of SNP and SSR markers and establishment of parentage analysis technique in Scylla paramamosain[D].Shanghai:Shanghai Ocean University,2012.馬群群.擬穴青蟹SNP和SSR標記開發(fā)及系譜認證技術(shù)的建立研究[D].上海:上海海洋大學(xué),2012.

[35] CHEN L Z,WANG X F,WANG S.China's biodiversity and its protection countermeasures[M].Beijing:Science Press,1993.陳靈芝,王獻溥,汪松.中國的生物多樣性:現(xiàn)狀及其保護對策[M].北京:科學(xué)出版社,1993.

[36] WAN Y M,WANG L,TAN Z J,et al.Genetic analysis of two Takifugu rubripes populations and correlation of microsatellite markers and economic traits[J].Freshwater Fisheries,2011,41(5):9-16.萬玉美,王蕾,譚照君,等.紅鰭東方鲀兩個群體的遺傳結(jié)構(gòu)及與經(jīng)濟性狀的相關(guān)性分析[J].淡水漁業(yè),2011,41(5):9-16.

[37] XU X,WANG J Y,JIANG J Z,et al.Studies on the genetic structure of Haliotis diversicolor reeve in coastal area of Guangdong Province by microsatellite markers[J].Advances in Marine Science,2012,30(2):284-294.許新,王江勇,姜敬哲,等.廣東沿海雜色鮑養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析[J].海洋科學(xué)進展,2012,30(2):284-294.

Parentage Determination of the Takifugu rubripes Families by Microsatellite Markers

SUN Jian-hua1,2,3,MA Ai-jun2,3,CUI Wen-xiao1,2,3,WANG Guang-ning2,3,SUN Zhi-bin2,3, WANG Xin-an2,3,MENG Xue-song4,LIU Sheng-cong4,ZHANG Tao4
(1.Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China; 2.Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China; 3.Laboratory for Marine Biology and Biotechnology,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266071,China; 4.Dalian Tianzheng Industrial Co.Ltd.,Dalian 116000,China)

Takifugu rubripes is one of the ecnomic sea fish in northern coast of China.In recent years, there are few studies on genetic diversity and genealogical information of Takifugu rubripes.In this study the genetic diversity and genealogical information of Takifugu rubripes were investigated,providing the basis of theory for genetic improvement.Five families were randomly sampled from twelve families which have been established in 2015.Eight pairs of microsatellite primers were used to identify the genealogy and analyze the genetic diversity among five cultured populations of Takifugu rubripes.Thirty-two alleles were detected at eight microsatellite loci.The number of alleles(A)at each locus ranged from three to six with an average of four.The value of average observed heterozygosities was 0.453 3～0.953 3.The expected heterozygosities(He)was 0.490 8～0.790 1 and the mean polymorphic information content(PIC) ranged from 0.455 5 to 0.754 6.Eight family unique alleles were found out:three in 7#family,two in 3#family,two in 11#family,one in 12#family.Family unique allele was not found in family 10#.Based on the genotypes of offspring,all parental genotypes of the five families were successfully deduced.3#family and 11#family were identified from the other families at locus fms15.7#family was separated from the other families at locus TOG01.12#family was distinguished from the other families at locus f1497.The three microsatellite markers(fms15,TOG01,f1497)could be used to identify five families.Results show that there exists high genetic diversity among the five families.The five families could be identified using at least three microsatellite markers selected from Eight microsatellite markers.Microsatellite marker is an useful tool for genealogical identification of Takifugu rubripes.And it is a reliable basis for molecular marker-assisted breeding in the future.

Takifugu rubripes;microsatellite;genetic diversity;genealogical identification

June 30,2016

Q953

A

1671-6647(2017)03-0392-12

10.3969/j.issn.1671-6647.2017.03.009

2016-06-30

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項——紅鰭東方鲀育種群體的遺傳差異和生長性狀的遺傳分析(20603022012005);大連金州新區(qū)科技計劃項目資助——紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)大規(guī)模家系選育技術(shù)研究(2012-B1-012)

孫建華(1991-),男,甘肅金昌人,碩士研究生,主要從事海水魚類增養(yǎng)殖方面研究.E-mail:sjhxy91@outlook.com

*通訊作者:馬愛軍(1971-),女,山東榮成人,研究員,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事海水魚類增養(yǎng)殖方面研究.E-mail:maaj@ysfri.ac.cn