唐 萌，張艮林，黃雄英，萬 靜，張紫涵

(1.云南大學(xué)建筑與規(guī)劃學(xué)院，云南 昆明650091；2.云南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明650091；3.國(guó)際河流與生態(tài)安全研究院，云南 昆明650091；4.云南大學(xué)生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明650091)

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一株耐砷菌的鑒定及處理含砷廢水研究

唐 萌1，張艮林2，黃雄英3，萬 靜4，張紫涵4

(1.云南大學(xué)建筑與規(guī)劃學(xué)院，云南 昆明650091；2.云南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明650091；3.國(guó)際河流與生態(tài)安全研究院，云南 昆明650091；4.云南大學(xué)生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明650091)

對(duì)從云南省個(gè)舊市大屯海篩選出的一株耐砷菌進(jìn)行鑒定和除砷性能研究。經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA測(cè)序鑒定其為庫克菌(Kocuria carniphila)。實(shí)驗(yàn)表明，此菌對(duì)模擬廢水中的As(Ⅲ)具有較好的去除效果。當(dāng)pH值為8，發(fā)酵液投加量為5mL，CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)除砷率達(dá)到最大值55%。

耐砷菌；16S rDNA測(cè)序；含砷廢水處理

砷(As)稱為類金屬，在世界范圍內(nèi)廣泛存在，雖然含量很少，但卻是地殼中毒性最大的元素之一，其豐度為2 g/t。含砷廢水主要來源于有色金屬冶煉、硫化物的開采利用、農(nóng)藥、染料、制酸、合金、玻璃及防腐劑等工業(yè)的排水，因此每年因工業(yè)生產(chǎn)會(huì)使大量的砷進(jìn)入到環(huán)境中。

美國(guó)權(quán)威科學(xué)雜志公布的調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)的新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、云南、河南和山東等地都是砷污染高危地區(qū)，砷含量高于10 μg/L的地區(qū)總面積約為58萬km2，近2000多萬人生活在砷污染高危地區(qū)[1-3]。由于水體砷污染對(duì)人體的危害，1993年世界衛(wèi)生組織將飲用水中的砷標(biāo)準(zhǔn)由原來的50 μg/L降低為10 μg/L。在2007年,我國(guó)也將飲用水中的砷標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整為10 μg/L，2006年美國(guó)環(huán)保局將砷列為第一位飲用水污染物[4-7]。水體砷污染已經(jīng)造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題，受到了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。本文通過對(duì)除砷微生物的研究，希望能發(fā)現(xiàn)并找到對(duì)砷有較高去除率的微生物，從而為微生物法除砷機(jī)理探究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種前期篩選自云南省個(gè)舊市大屯海，現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

種子培養(yǎng)基：酵母浸膏5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，初始pH為7.0，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40.0 g/L、磷酸氫二鉀(分析純)5.0 g/L、磷酸二氫鉀(分析純)2.0 g/L、氯化鈉(分析純)0.1 g/L、酵母浸膏4.0 g/L、硫酸鎂(分析純)0.2 g/L，pH=7.0，115℃下滅菌15 min。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察

細(xì)菌個(gè)體觀察：采用傳統(tǒng)革蘭氏染色法，取經(jīng)活化20 h的菌液，通過涂片、干燥和固定后，再進(jìn)行初染、媒染、脫色、復(fù)染等步驟，最后進(jìn)行觀察。若菌體呈紅色，則為革蘭氏陰性菌；若菌體呈藍(lán)紫色，則為革蘭氏陽性菌。

細(xì)菌菌落觀察：取經(jīng)活化20 h的菌液，稀釋后用涂布器涂布到LB固體培養(yǎng)基上，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征。

1.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)[8,9]

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，本實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行了明膠液化實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、伏-普實(shí)驗(yàn)(VP實(shí)驗(yàn))、葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)和吲哚實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 16S rDNA序列鑒定[10-13]

DNA的提取采用土壤中總DNA的提取方法，設(shè)計(jì)PCR引物為：Eu 7F，5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；Eu 1540R，5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR程序設(shè)定為：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 45sec、55℃ 45 sec、72℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃修復(fù)延伸10min；4℃保溫。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，所得16S rDNA序列提交到Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中，將16S rDNA序列與已知序列進(jìn)行比對(duì)，下載與該菌株同源性較高的序列，通過Clustal軟件進(jìn)行分析，然后用MEGA軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 除砷條件優(yōu)化研究

實(shí)驗(yàn)以模擬廢水為研究對(duì)象，分別進(jìn)行了不同的pH、發(fā)酵液投加量、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)速等條件下的單因素實(shí)驗(yàn)，處理后的反應(yīng)液采用原子熒光法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)研究

此菌株的形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果表明：菌落形態(tài)成圓形、邊緣整齊、淡粉色、蠟狀、菌落小，表面濕潤(rùn)光滑，細(xì)胞形態(tài)成較大球形(如圖1所示)。

2.1.2 菌株的生理生化特征研究

此菌株的生理生化特征研究結(jié)果如表1所示。

表1 菌株的生理生化特征研究結(jié)果

2.1.3 16S rDNA鑒定

將PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，并將所得16S rDNA序列與Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行對(duì)比，然后經(jīng)Clustal軟件進(jìn)行同源性分析，并用MEGA軟件構(gòu)建出該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2所示)。

從菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，此菌株與庫克菌(Kocuria carniphila)在同一個(gè)分支上，并且此菌株的基因序列與庫克菌(Kocuria carniphila)的基因序列的同源性達(dá)到了98.3%。

因此，通過對(duì)此菌株的生理生化特征研究和16S rDNA測(cè)序鑒定，我們可以認(rèn)為此菌株為庫克菌(Kocuria carniphila)。

2.2 除砷條件優(yōu)化研究

2.2.1 pH值對(duì)除砷率的影響

配制50 mL濃度為100 mg/L的含As廢水5份，分別置于5個(gè)250 mL的三角瓶中，加入4 mL發(fā)酵液和5 mL 10%的CaCl2溶液，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值分別為2、4、6、8、10。置于30℃的恒溫震蕩箱中，以150 r/min的轉(zhuǎn)速處理2 h，靜置20 min取其上清液測(cè)定殘留As濃度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖3所示。

由圖3可以看出，當(dāng)pH在2～8時(shí)，除砷率隨pH的增大而逐漸增高；pH值在8～10時(shí)，除砷率隨pH的增大而減??；當(dāng)pH值為8時(shí)，除砷率達(dá)到了最大值33.73%。由此可以看出，此菌株在偏堿性的環(huán)境中除砷率效果更好。

2.2.2 發(fā)酵液投加量對(duì)除砷率的影響

配制50 mL濃度為100 mg/L的含As廢水5份，分別置于5個(gè)250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8，再加入5 mL 10%的CaCl2溶液，分別調(diào)節(jié)發(fā)酵液投加量為0、1、2、3、4、5、6 mL。置于30℃的恒溫震蕩箱中，以150 r/min的轉(zhuǎn)速處理2 h，并靜置20 min取其上清液測(cè)定殘留As濃度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖4所示。

由圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵液的投加量為0～1時(shí)，除砷率出現(xiàn)了劇增，除砷率從投加量為0時(shí)的6%增大到了發(fā)酵液為1時(shí)的36.62%；當(dāng)發(fā)酵液投加量繼續(xù)增大時(shí)，除砷率也在逐漸增大。當(dāng)發(fā)酵液投加量為5 mL時(shí)，除砷率達(dá)到了最大值47.66%，此后隨著發(fā)酵液投加量的增大，除砷率反而減小。因此對(duì)于此菌株而言，發(fā)酵液投加量為5 mL時(shí)為最佳投加量。

2.2.3 CaCl2濃度對(duì)除砷率的影響

配制50 mL濃度為100 mg/L的含As廢水5份，分別置于5個(gè)250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8，發(fā)酵液投加量為5 mL，再加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)為0、5、10、15、20、25的CaCl2溶液。置于30℃的恒溫震蕩箱中，以150 r/min的轉(zhuǎn)速處理2 h，并靜置20 min取其上清液測(cè)定殘留As濃度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖5所示。

由圖5可知，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CaCl2溶液對(duì)除砷率也有一定的影響。當(dāng)不投加CaCl2溶液時(shí)，除砷率只有41%；當(dāng)CaCl2溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，除砷率達(dá)到了最大值55%。之后隨著CaCl2溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，除砷率緩慢減小。由此可知，CaCl2溶液對(duì)菌株的除砷有一定的促進(jìn)作用。對(duì)此菌株而言，CaCl2溶液的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)除砷率的影響

配制50 mL濃度為100 mg/L的含As廢水5份，分別置于5個(gè)250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8，發(fā)酵液投加量為5 mL，再加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CaCl2溶液，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為100、140、180、220、260、300 r/min。置于30℃的恒溫震蕩箱中，處理2 h，并靜置20 min取其上清液測(cè)定殘余As濃度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖6所示。

由圖6可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100～180 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加除砷率也在逐漸增大，在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，除砷率達(dá)到了最大值55%。之后隨著轉(zhuǎn)速的持續(xù)增大，除砷率反而減小。因此可以看出，對(duì)于此菌株除砷的最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min。

3 結(jié)論與趨勢(shì)

本實(shí)驗(yàn)從云南省個(gè)舊市大屯海篩選出來的菌株，對(duì)模擬廢水中的As(Ⅲ)具有較好的去除效果。經(jīng)生理生化特征研究和16S rDNA鑒定，此菌株為庫克菌(Kocuria carniphila)。菌株的除砷率已達(dá)到了55%，后期的研究中我們將對(duì)菌株的除砷機(jī)理進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步揭示此菌株對(duì)水體As(Ⅲ)的去除機(jī)制。

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The Identification of an Arsenic-Resistant Bacteria and its Ability of Treating Arsenic-containing Wastewater

TANG Meng1,ZHANG Gen-lin2,HUANG Xiong-ying3,WAN Jing4,ZHANG Zi-han4

(1.School of Architecture and Planning,Yunnan University, KunmingYunnan 650091,China)

The study on identification and arsenic removal performance of an arsenic-resistant bacteria’s from DatunLakeinGeJiu in Yunnan Province was conducted.It was identified to be Kocuriacarniphilathrough physiological and biochemical experiment and 16SrDNA sequence analysis.Experimental results showed that the bacteriahad a better removal effectforAs(Ⅲ)from simulated wastewater.The bacteria’s arsenic removal rate could reach 55%when the pH was 8,the amount of fermentation liquid was 5ml,the mass fraction of CaCl2was 5%, and the shaker’s rotating speed was 180r/min.

arsenic-resistant bacteria; 16SrDNA sequence analysis; treatment of arsenic-containing wastewater.

2017-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金(51468065)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014FB111)；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助性項(xiàng)目研究生項(xiàng)目(2016yjs004)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510673006；201610673005)。

唐萌(1993-)，男，陜西省寶雞市人，碩士研究生，研究方向：重金屬污染防治。

張艮林(1978-)，男，副研究員，博士，研究方向：水體重金屬污染治理技術(shù)與應(yīng)用。

X703

A

1673-9655(2017)05-0024-04