楊曉冉，朱 超，張付海，胡雅琴，張 敏

(安徽省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站,安徽 合肥 230061)

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固定酶底物法測(cè)定水中糞大腸菌群的優(yōu)點(diǎn)及影響因素

楊曉冉，朱 超，張付海，胡雅琴，張 敏

(安徽省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站,安徽 合肥 230061)

使用酶底物法和多管發(fā)酵法檢測(cè)水質(zhì)中的糞大腸菌群，結(jié)果表明，兩種方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并無顯著差異。酶底物法具有操作快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度也高于多管發(fā)酵法。酶底物法可以采用成品的培養(yǎng)基及試劑，操作方便，無需確認(rèn)試驗(yàn)，20 h即可判斷水樣中糞大腸菌群的MPN值，實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否無菌對(duì)酶底物法測(cè)定水中糞大腸菌群的影響不大，但是培養(yǎng)溫度對(duì)結(jié)果影響較大。

糞大腸菌群；環(huán)境監(jiān)測(cè)；酶底物法；多管發(fā)酵法；快速檢測(cè)；影響因素

糞大腸菌群(Fecal coliform)主要來自糞便，它在44～44.5℃的高溫條件下仍可生長(zhǎng)繁殖并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，其他特性均與總大腸菌群(Total coliform)相同。因此，可用提高培養(yǎng)溫度的方法造成不利于來自自然環(huán)境的大腸菌群生長(zhǎng)的條件，使培養(yǎng)出來的菌主要為來自糞便中的大腸菌群，從而更準(zhǔn)確地反映出水質(zhì)受糞便污染的情況。糞大腸菌群細(xì)菌在衛(wèi)生學(xué)上具有重要的意義。

目前水中糞大腸桿菌群(耐熱大腸菌群)的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法和濾膜法，并且已經(jīng)列入環(huán)保行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法，此兩種傳統(tǒng)方法被國(guó)內(nèi)環(huán)境檢測(cè)部門廣泛采用。傳統(tǒng)方法實(shí)驗(yàn)操做需要較多的試劑和器材，步驟繁瑣，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，培養(yǎng)基保存時(shí)間短，陽性結(jié)果需驗(yàn)證試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無菌程度要求也比較高，不能對(duì)水的衛(wèi)生學(xué)狀況做出快速評(píng)價(jià)，制約了其應(yīng)用。

固定底物酶底物法利用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D galactosidase)分解ONPG(Ortho-nitrophenyl -β-D galactopyranoside)使培養(yǎng)液呈黃色，來判斷水樣中是否含有大腸菌群、糞大腸菌群(耐熱大腸菌群)。目前被美國(guó)、歐洲及大部分亞洲國(guó)家廣泛應(yīng)用于水中總大腸桿菌、糞大腸菌群(耐熱大腸菌群)及大腸埃希氏菌的檢測(cè)，并通過美國(guó)EPA、《水與廢水標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法》以及我國(guó)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》認(rèn)證。

本文通過比對(duì)試驗(yàn)，證實(shí)了酶底物法和多管發(fā)酵法在統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果上無顯著差異，并對(duì)影響酶底物法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

乳糖蛋白胨和EC肉湯培養(yǎng)基；高溫壓力滅菌器；3 mm 接種環(huán)；科立得TM(Colilert R)試劑(美國(guó)愛德士生物科技股份有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)菌株 IDEXX-QC(大腸埃希氏菌，MPN值/100 mL標(biāo)準(zhǔn)值341/100 mL，可接受范圍34～703/100 mL)無菌取樣瓶(里面裝有1.5%硫代硫酸鈉去除水樣中的余氯)；97孔定量盤；封口機(jī)(帶97孔定量盤橡膠托墊)；97孔陽性標(biāo)準(zhǔn)比色盤；培養(yǎng)箱。

1.2 樣品來源

巢湖入湖口水源水，某污水處理廠出水，某固廢處理廠出水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多管發(fā)酵法

參考《GB/T5750.12-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》和《HJ/T 347-2007水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法和濾膜法(試行)》，具體操作步驟詳見表1。

1.3.2 酶底物法

具體操作方法詳見表1。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可行度評(píng)價(jià)

采用糞大腸菌群質(zhì)控樣品IDEXX-QC(大腸埃希氏菌，批號(hào)：012116)，來自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌庫(NCTC)9001(批號(hào)111815)，用無菌水稀釋到一定的倍數(shù)，分別用酶底物法和多管發(fā)酵法培養(yǎng)，查MPN表得出結(jié)果。如表2所示，兩種方法的測(cè)定結(jié)果均在質(zhì)控范圍內(nèi)。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=0.63，P>0.05。

2.2 兩種方法的比對(duì)分析

采用多管發(fā)酵法和酶底物法同時(shí)測(cè)定巢湖入湖口。

表1 多管發(fā)酵法、酶底物法測(cè)定水中糞大腸菌群方法的比較

水樣共計(jì)36個(gè)(樣品編號(hào)1-36)，某污水處理廠出口水樣(生活廢水)共計(jì)8個(gè)(樣品編號(hào)37-44)，某固廢處理中心出口水樣共計(jì)8個(gè)(樣品編號(hào)45-52)，總計(jì)52個(gè)。分析結(jié)果如圖1所示。線性回歸分析見圖2。線性回歸方程為y=0.9974x+0.6025，r2=0.81。兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)在指數(shù)水平上具有較好的一致性。

2.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)酶底物法分析結(jié)果的影響

在同一個(gè)點(diǎn)位采樣8份，用酶底物法分別在無菌操作間、非無菌實(shí)驗(yàn)室、室外環(huán)境中進(jìn)行檢測(cè)，分析結(jié)果如圖3所示。將非無菌室和室外檢測(cè)的結(jié)果分別與無菌室中檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析，t值分別為0.57和0.91，P>0.05。因此，酶底物法與實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否無菌關(guān)系不大。

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)酶底物法分析結(jié)果的影響

在8個(gè)不同的點(diǎn)位采集水樣，用酶底物法在40～49℃進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如表3。將44℃和45℃兩組培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)P檢驗(yàn)，t=1.39，P>0.05，兩組數(shù)據(jù)無顯著性差異。但是40℃、42℃、47℃和49℃的培養(yǎng)結(jié)果與44℃相比，均有顯著性差異(P<0.05)。

糞大腸菌群的最佳培養(yǎng)溫度為44.5±0.5℃。如果培養(yǎng)溫度過低，除了糞大腸菌群之外的其他大腸菌群會(huì)有部分繼續(xù)生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致結(jié)果偏高。而培養(yǎng)溫度過高，糞大腸菌群會(huì)停止生長(zhǎng)，導(dǎo)致結(jié)果偏低。因此，酶底物法分析糞大腸菌群需嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度。

表2 質(zhì)控樣品的分析結(jié)果

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶底物法分析結(jié)果的影響

在8個(gè)不同的點(diǎn)位采集水樣，在44.5±0.5℃的溫度下培養(yǎng)，定時(shí)觀察培養(yǎng)結(jié)果。12 h以內(nèi)培養(yǎng)物的顯色不明顯，不易判斷陽性結(jié)果，約20 h培養(yǎng)物陽性數(shù)量和顏色會(huì)達(dá)到穩(wěn)定。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至36 h，陽性數(shù)量基本不變化。如圖4所示，酶底物法測(cè)定水中糞大腸菌群， 20 h左右即可判斷陽性結(jié)果。

3 結(jié)論

酶底物法和多管發(fā)酵法檢測(cè)水中糞大腸菌群的結(jié)果一致性方面無顯著性差異，且酶底物法的檢測(cè)靈敏度高于多管發(fā)酵法。酶底物法可以采用成品的培養(yǎng)基及試劑，操作方便，無需確認(rèn)試驗(yàn)，20 h即可判斷水樣中糞大腸菌群的MPN值，實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否無菌對(duì)酶底物法測(cè)定水中糞大腸菌群的影響不大，但是培養(yǎng)溫度對(duì)結(jié)果影響較大。因此，酶底物法較好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足，可以替代多管發(fā)酵法在常規(guī)監(jiān)測(cè)和應(yīng)急污染事故中做出快速評(píng)價(jià)。

表3 不同培養(yǎng)溫度下的分析結(jié)果

[1]本書編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版)[M]. 北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 2002.

[2]水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法和濾膜法(試行):HJ/T 347-2007[S].

[3]生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo):GB/T 5750. 12-2006[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.

[4]湯琳，李備軍，龔海燕，張錦平.糞大腸菌群酶底物法在環(huán)境應(yīng)急監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J].環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)， 2013(6).

[5]高瑞坤，湯琳，付強(qiáng).水中糞大腸菌群快速檢測(cè)方法-固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法的比較[J].中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)，2008，24 ( 4): 39-41.

Analysis of the Advantages and Influential Factors of Fecal Coliform Determination in Water by Enzyme Substrate Technique

YANG Xiao-ran, ZHU Chao, ZHANG Fu-hai, HU Ya-qing, ZHANG Min

(Anhui Provincial Environmental Monitoring Centre, Hefei Anhui 230061, China)

The enzyme substrate technique and multi-tube fermentation technique to detect the fecal coliform in various types of water were applied. The results showed that the two methods were no significant difference in statistics. The enzyme substrate technique had the advantages of rapidity and easy operation. Its detection sensitivity was higher than multi-tube fermentation technique. The enzyme substrate technique could use mature culture medium and regents with simple operation without confirmation test. The MPN value of fecal coliform could be identified after 20 hours. Meanwhile, there were no impacts of laboratory environment with bacteria or not on the experimental results. However, the culture temperature would affect the results.

fecal coliform; environmental monitoring; enzyme substrate technique; multi-tube fermentation technique; rapid detection; influential factor

2017-03-17

楊曉冉(1980-)，女，安徽合肥人，工程師，碩士，主要從事水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)工作。

X83

A

1673-9655(2017)05-0087-04