蔣麗琴，陳恩，王超

（1.南華大學(xué)附二醫(yī)院 湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附一醫(yī)院 湖南 衡陽 430400）

MICA基因多態(tài)性及單倍型多樣性與卵巢癌的易感關(guān)聯(lián)性研究

蔣麗琴1，陳恩2，王超1

（1.南華大學(xué)附二醫(yī)院 湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附一醫(yī)院 湖南 衡陽 430400）

目的探討中國南方漢族人群MICA等位基因多態(tài)性和卵巢癌發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)。方法采用PCRSSP及PCR-SBT方法對外周血標本的目的基因進行檢測。結(jié)果中國南方漢族卵巢癌組患者外周血標本中檢測到11種MICA等位基因；和對照組相比較，MICA*010等位基因在卵巢癌組患者中分布頻率升高。卵巢癌患者組中檢測到5種MICA-STR等位基因，但其與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；卵巢癌患者組MICA*010/010純合子出現(xiàn)率增加，提示其對卵巢癌可能易感（＾OR=14.82，95%CI：1.89，115.94，P<0.05）。結(jié)論MICA等位基因多態(tài)性與中國南方漢族卵巢癌的發(fā)生有相關(guān)性。

MICA基因；基因多態(tài)性；卵巢癌

Abstract:ObjectiveTo study the association between theMICAgene polymorphism and haplotype diversity with the susceptibility of ovarian cancer.MethodsPCR-SSP and PCR-SBT were used to analyze the gene polymorphism and haplotype diversity of MICA in ovarian cancer patients and healthy individuals.ResultsEleven MICA allele genes were found in the south China ovarian cancer patients,and the frequency of MICA*010 was higher in south China ovarian cancer patients than in healthy controls,presenting genic susceptibility to ovarian cancer(O＾R=6.43,95%CI:3.51,11.76,P<0.05).Five MICA-STR alleles were detected,but there was no significant difference between the case and the control.Compared to the control group,the distribution frequency of MICA*010/010 was significantly high and it is probably a susceptibility genotype to ovarian cancer(O＾R=14.82,95%CI:1.89,115.94,P<0.05).ConclusionsMICAallele gene polymorphism and haplotype diversity may be associated with ovarian cancer.

Keywords:MICA alleles;gene polymorphism;ovarian cancer

卵巢癌（ovarian cancer，OC）患病率高，占婦科惡性腫瘤的23%，是導(dǎo)致成年女性死亡的常見疾病[1-2]。其預(yù)后差，目前沒有早期診斷的方法，據(jù)報道，在已經(jīng)確診的患者中，超過60%患者有腫瘤細胞的盆腔和（或）遠處轉(zhuǎn)移，屬于Ⅲ期或Ⅳ期晚期病例，因此早期預(yù)防十分必要[3]。卵巢癌的發(fā)病機制與多種因素有關(guān)，以往的研究表明，遺傳背景也是其重要的發(fā)病原因之一。主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類鏈相關(guān)基因A（MHC class I related chain A，MICA）與人體免疫及腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，具有廣泛的多態(tài)性[4]。20世紀末，由美國SPIES教授首先報道[5]。以往的研究表明，MICA基因與多種疾病發(fā)生有關(guān)聯(lián)，尤其是腫瘤疾病，但暫無與中國南方人群卵巢癌患者易感性相關(guān)報道[6-8]。因此，本研究以卵巢癌患者作為研究對象，從MICA基因多態(tài)性這個角度觀察其與中國南方漢族卵巢癌之間是否具有關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2012年9月-2015年10月在南華大學(xué)附二醫(yī)院就診并通過病理學(xué)等檢查臨床明確診斷為卵巢癌的患者；對其TNM分期不做限制；患者除卵巢癌外不能合并其他有遺傳傾向的疾病。所有患者需在中國南方至少定居3代，且全部為漢族人群。招募到110例符合研究標準的患者，平均56.1歲（35～78歲）。招募124例健康志愿者，平均45.6歲（20～69歲），作為對照組。研究對象間無親屬關(guān)系。研究經(jīng)南華大學(xué)附二醫(yī)院倫理委員會審核，符合相關(guān)要求。

1.2 基因的提取及分型

參考相關(guān)文獻，在外周血中提取DNA，對目標基因分型[9]。本研究采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）與聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序分型（polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT）的方式[10-13]。PCR-SSP由設(shè)計的67個引物對組成。通過組合等方式，設(shè)計出不同基因型別所對應(yīng)的不同組合方式，繪制出格局表（引物序列和格局表同參考文獻[14]）；對每一標本進行68對PCR反應(yīng)（其中一孔為陰性對照），每次反應(yīng)都需加入內(nèi)參；內(nèi)參為人生長激素基因，引物序列如下，正向引物：5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3'；反向引物：5'-GAGAAAGGCCTGGAGGATTC-3'。產(chǎn)物長度 834 bp。

根據(jù)格局表可確立該標本的MICA等位基因型；根據(jù)MICA分型格局表對MICA基因的等位基因型別進行分析判斷。將獲得MICA等位基因的基因型別，采用Anthony Nolan Trust數(shù)據(jù)庫查詢獲得MICA-STR型別。部分如MICA*002：01與MICA*020等的基因型別無法用PCR-SSP方法檢出，也為驗證PCR-SSP方法的可靠性，PCR-SBT方法對部分樣本的MICA等位基因進行分型分析。擴增引物和測序引物參見文獻[14]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

MICA等位基因頻率、MICA基因型頻率及遺傳平衡檢驗（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）采用SHESIS軟件進行計算獲得[11]；等關(guān)聯(lián)性分析用Logistic回歸分析；采用Fisher精確概率法對其進行檢驗。P值采用Bonferroni校正后得到的Pc值在5%水平上進行檢驗[11]。

2 結(jié)果

2.1 兩組Hardy-Weinberg平衡吻合度情況

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗分析表明，各等位基因的分布理論頻率與觀察頻率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明本實驗所選樣本是符合Hardy-Weinberg平衡的隨機婚配群體。

2.2 MICA基因型確定

MICA基因擴增，擴增產(chǎn)物的電泳圖（見圖1），參照MICA分型格局表，判定該隨機研究對象。MICA基因型為MICA*010/010。

2.3 PCR-SBT方法檢測MICA基因

對研究對象基因組DNA擴增MICA的PCR產(chǎn)物（2.2kb）（見圖2），每一泳道為1個個體的DNA樣本。對樣本經(jīng)基因測序所顯示的MICA基因（見圖3）。

圖1 MICA基因擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 隨機標本MICA基因PCR結(jié)果

圖3 某研究對象MICA基因

2.4 MICA基因與中國南方漢族卵巢癌之間的相關(guān)性

中國南方漢族卵巢癌患者中共檢出11種MICA基因表型。其中，MICA*00201、MICA*010及MICA*019為最常見3種MICA表型，分別占20.90%、20.45%及19.55%。與健康對照組相比較，MICA*010等位基因在中國南方漢族卵巢癌組患者出現(xiàn)的頻率增高（20.45%vs 6.05%），可能對卵巢癌易感（=6.42，95%CI：3.51，11.76，P<0.05）。見表 1。

2.5 MICA-STR基因與中國南方漢族卵巢癌之間的相關(guān)性

MICA-STR等位基因中國南方漢族卵巢癌組觀測到5種，最高分布頻率的是MICA-A5，占40.0%，與健康組比較，中國南方漢族卵巢癌組的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.6 中國南方漢族卵巢癌相關(guān)性同MICA單倍型多樣性的比較

對比結(jié)果顯示，MICA*010/010純合子基因型在中國南方漢族卵巢癌組中的出現(xiàn)頻率與健康組對比增高（10.91%vs 0.82%），提示其可能為易感基因型（=14.83，95%CI：1.89，115.94，P<0.05）。見表 3。

表1 MICA各等位基因型頻率比較

表2 MICA-STR各等位基因頻率比較

表3 MICA各等位基因型頻率比較

續(xù)表3

3 討論

目前，在全世界范圍內(nèi)已有許多學(xué)者研究不同基因類型與卵巢癌發(fā)病機制的關(guān)系。黃娟等人[15]研究表明，卵巢癌發(fā)病風(fēng)險與IL-6基因有一定關(guān)聯(lián)；陳平平等人[16]研究發(fā)現(xiàn)，XRCC3基因與卵巢癌的發(fā)生存在相關(guān)性；李琰等[17]報告，MMP-12、13啟動子區(qū)A/G型為卵巢癌易感因素；本研究表明，遺傳條件對卵巢癌發(fā)病有明顯的影響。

MICA基因存在廣泛的多態(tài)性，許多疾病，如免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤均與其有關(guān)[12-13，18]。本研究檢測中國南方漢族人群卵巢癌患者及正常對照人群的MICA基因多態(tài)性，實驗顯示，有11種MICA等位基因在卵巢癌患者組被檢測出，其中，MICA*00201、MICA*010和MICA*019是患者組中分布頻率最高的3種MICA等位基因；與健康對照組相比較，MICA*010等位基因在中國南方漢族卵巢癌患者中出現(xiàn)的頻率增高，MICA*010等位基因為中國南方漢族卵巢癌的可疑相關(guān)基因（=6.42，95%CI：3.51，11.76，P<0.05）。MICA-STR等位基因中國南方漢族卵巢癌組觀測到5種，最高分布頻率的是MICA-A5，占40.0%，與健康組比較，中國南方漢族卵巢癌組的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果表明，MICA等位基因與卵巢癌的發(fā)病有一定關(guān)聯(lián)。由于MICA基因的產(chǎn)物能夠與多種免疫細胞的細胞膜上的受體發(fā)生作用，從而是多種免疫細胞在抑制腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用，故在本研究中，筆者推測可能是某些MICA基因的類型的個體，其MICA基因的生物學(xué)活力下降、產(chǎn)物不能很好地促進免疫細胞發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用，從而導(dǎo)致最終卵巢癌的發(fā)生[11]。GAMBELUNGHE等發(fā)現(xiàn)，MICA-A5.1基因與SLE 的易感關(guān)系明顯[11，19]，邢永華研究組報告MICA-A5.1基因與胃癌的發(fā)生有關(guān)[11，20]，同時可以觀察到許多其他的病種也和MICAA5.1 基因相關(guān)[11，21-22]。本實驗結(jié)果中，MICA-STR等位基因的分布頻率在兩組中無差異。引起該結(jié)果的原因可能有以下幾點：①不同腫瘤細胞具有不同的特性，雖然該基因與其他疾病密切相關(guān)，但確實與卵巢的發(fā)生相關(guān)性不高[11]。②標本數(shù)量偏少，一種MICASTR型別包括多種等位基因，如MICA-A5.1包括MICA*008、MICA*23、MICA*28及MICA*054等位基因，需要更多的樣本來反映該等位基因的分布規(guī)律。③MICA在卵巢癌細胞的生長過程中脫落[23-24]，產(chǎn)生所謂的腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象[11]。

本研究選擇的研究對象為中國南方漢族人群，以往的研究已經(jīng)證實，MICA基因型會在各種人群表現(xiàn)出差異。因此，將來仍需選取其他不同人群作為研究對象，觀察其他人群中，卵巢癌的發(fā)生與MICA基因多態(tài)性之間的關(guān)系，為將來了解卵巢癌的發(fā)生與不同基因型之間的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

[1]婁雪玲，張麗麗，王巧紅，等.先期化療聯(lián)合術(shù)后腹腔熱灌注化療治療晚期卵巢癌療效觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2015(11):80-82.

[2]SPRIGGS D R,LONGO D L.PARP Inhibitors in Ovarian Cancer Treatment[J].N Engl J Med,2016,375(22):2197-2198.

[3]戴芙蓉.Chi-29b嵌合體在卵巢癌中的抗癌作用及機制研究[D].長沙:中南大學(xué),2014.

[4]BAHRAM S.MIC genes:from genetics to biology[J].Adv Im-munol,2000(76):1-60.

[5]BAHRAM S,BRESNAHAN M,GERAGHTY D E,et al.A second lineage of mammalian major histocompatibility complex class I genes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(14):6259-6263.

[6]GLAS J,MARTIN K,BRUNNLER G,et al.MICA,MICB and C1_4_1 polymorphism in Crohn's disease and ulcerative colitis[J].Tissue Antigens,2001,58(4):243-249.

[7]KIMURA T,GOTO K,YABUKI K,et al.Microsatellite polymorphism within theMICBgene among Japanese patients with Behcet's disease[J].Hum Immunol,1998,59(8):500-502.

[8]LU M,XIA B,LI J,et al.MICB microsatellite polymorphism is associated with ulcerative colitis in Chinese population[J].Clin Immunol,2006,120(2):199-204.

[9]GONG Z,LUO Q Z,LIN L,et al.Association ofMICAgene polymorphisms with liver fibrosis in schistosomiasis patients in the Dongting Lake region[J].Braz J Med Biol Res,2012,45(3):222-229.

[10]CHEN E,LIN L,CHEN C J,et al.MIC gene polymorphism and haplotype diversity in Zhuang nationality of Southern China[J].Hum Immunol,2014,75(9):953-959.

[11]陳恩，鄒學(xué)森，聶德魁，等.MICA基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感關(guān)聯(lián)性研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2016(5):545-549.

[12]李瑜，陳純靜，王芙艷，等.MICB基因多態(tài)性與肺癌的易感關(guān)聯(lián)性研究[J].激光生物學(xué)報,2016(1):69-74.

[13]郭家權(quán)，陳純靜，陳恩，等.乳腺癌與MICA基因多態(tài)性的相關(guān)性研究[J].激光生物學(xué)報,2015(2):170-174.

[14]龔拯.MICA/B基因多態(tài)性與血吸蟲病和白血病相關(guān)性研究[D].長沙:中南大學(xué),2012.

[15]黃娟，李丹青，孟健，等.白細胞介素16基因多態(tài)性與卵巢癌的相關(guān)性[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2015(1):14-15.

[16]陳平平，楊辰敏.DNA修復(fù)基因XRCC3多態(tài)性與卵巢癌相關(guān)性研究的meta分析[J].上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2015(5):718-723.

[17]李琰，張曉娟，康山，等.MMP-12、13基因啟動子區(qū)多態(tài)性與上皮性卵巢癌的關(guān)系[C].遺傳學(xué)進步與人口健康高峰論壇,2007:1.

[18]陳恩，鄒學(xué)森，聶德魁，等.MICA基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感關(guān)聯(lián)性研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2016(5):545-549.

[19]GAMBELUNGHE G,GERLI R,BOCCI E B,et al.Contribution of MHC class I chain-related A (MICA)gene polymorphism to genetic susceptibility for systemic lupus erythematosus[J].Rheumatology(Oxford),2005,44(3):287-292.

[20]邢永華，楊生璽，呂同德，等.青海漢族、回族、藏族MICA-TM基因多態(tài)性與胃癌相關(guān)性[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011(1):1-4.

[21]DHODAPKAR K M,CIRIGNANO B,CHAMIANF,et al.Invariant natural killer T cells are preserved in patients with glioma and exhibit antitumor lytic activity following dendritic cell-mediated expansion[J].Int J Cancer,2004,109(6):893-899.

[22]DHODAPKAR K M,CIRIGNANO B,CHAMIAN F,et al.Invariant natural killer T cells are preserved in patients with glioma and exhibit antitumor lytic activity following dendritic cell-mediated expansion[J].Int J Cancer,2004,109(6):893-899.

[23]ZHAO S,WANG H,NIE Y,et al.Midkine upregulates MICA/B expression in human gastric cancer cells and decreases natural killer cell cytotoxicity[J].Cancer Immunol Immunother,2012,61(10):1745-1753.

[24]GROH V,WU J,YEE C,et al.Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation[J].Nature.2002,419(6908):734-738.

[25]KAISER B K,YIM D,CHOW I T,et al.Disulphide-isomeraseenabled shedding of tumour-associated NKG2D ligands[J].Nature,2007,447(7143):482-486.

Association betweenMICAgene polymorphism and haplotype diversity with ovarian cancer

Li-qin Jiang1,En Chen2,Chao Wang1
(1.The Second Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China；2.The First Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 430400,China)

R392.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.010

1005-8982（2017）15-0047-06

2017-04-21

王超，E-mail：317249741@qq.com；Tel：13786404481