馬蕾+王施慧+劉淑梅+郎豐慶+紀(jì)復(fù)勤+李利斌+侯麗霞

摘 要：為了研究番茄和馬鈴薯CIPK3基因的功能，利用生物學(xué)信息學(xué)的方法從番茄和馬鈴薯的基因組中分別鑒定出2個與擬南芥CIPK3同源的基因，并對這些基因的結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)進(jìn)化和順式元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明，番茄和馬鈴薯的2個CIPK3基因均與擬南芥的CIPK3直系同源，且都含有14個外顯子，編碼區(qū)大小相似，編碼蛋白預(yù)測都位于細(xì)胞膜上且含有的基序類型相同；在它們的編碼區(qū)上游序列中均存在多個激素和逆境應(yīng)答元件，暗示它們在激素和逆境應(yīng)答中具有一定功能。

關(guān)鍵詞：番茄；馬鈴薯；CIPK3；基因特征；進(jìn)化；順式元件

中圖分類號：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.08.001

Abstract： To dissect the function of CIPK3 genes of tomato and potato， respectively identified two genes in the genome of tomato and potato homologous to Arabidopsis CIPK3 using bioinformatics method. And also the structure， characteristics， evolution， and cis-elemetnts of these genes were systematically analyzed. The results showed that， all these CIPK3 genes in tomato and potato were orthologs of AtCIPK3. And they all had 14 exons and similar coding sequence size. Their putative encoded proteins were all predicted to localized on membrane and had same type motifs. In the upstream of tomato and potato CIPK3 genomic sequences， there were multiple cis-elements responsive to plant hormones and environmental stresses， which suggested these gene may play some roles in the process of hormone and stress response.

Key words： tomato； potato； CIPK3； gene characteristics； evolution； cis-elements

馬鈴薯是我國重要的糧菜兼用作物，其抗逆性如何直接影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。目前，有關(guān)馬鈴薯抗性品種篩選[3-4]、抗逆生理[5-6]、抗性指標(biāo)篩選[7]以及抗逆基因克隆表達(dá)和轉(zhuǎn)移基因研究取得了很大進(jìn)展[8-9]。番茄是我國主要的栽培蔬菜之一，有關(guān)番茄非生物逆境抗性的研究日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，目前已取得很大進(jìn)展[10-14]。但是有關(guān)馬鈴薯和番茄CIPK基因的研究尚未見報道。CIPK家族是植物特有的激酶家族[15-16]，其作為細(xì)胞內(nèi)鈣信號系統(tǒng)的一員，在植物非生物逆境和生物逆境應(yīng)答[17-19]、ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[20-21]、礦質(zhì)營養(yǎng)吸收[22-24]和發(fā)育過程中具有重要功能[25-27]。其中，擬南芥的CIPK3在ABA和冷脅迫應(yīng)答、細(xì)胞內(nèi)鎂離子的動態(tài)平衡和鎂離子過量脅迫下的植株生長發(fā)育具有一定功能[21，24，28]。模式植物擬南芥CIPK的研究和番茄、馬鈴薯基因組測序的完成[29-30]，為解析番茄和馬鈴薯的CIPK基因及其功能提供了重要啟示。

本研究利用生物信息學(xué)的方法，分別從馬鈴薯和番茄基因組中鑒定出2個與擬南芥CIPK3直系同源的基因，并對它們的分子特征和遺傳進(jìn)化等進(jìn)行了系統(tǒng)分析，旨在為進(jìn)一步研究其在逆境應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 研究方法

利用擬南芥CIPK3基因序列搜索NCBI數(shù)據(jù)庫中的番茄和馬鈴薯CIPK3基因，利用motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch /cgi-bin/motif_scan） 對番茄和馬鈴薯CIPK3基因編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，并根據(jù)編碼區(qū)序列信息對其進(jìn)行染色體定位。利用Mega 4.1對番茄和馬鈴薯CIPK3基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。通過番茄和馬鈴薯CIPK3編碼區(qū)和基因組序列的比對來顯示基因外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)組成，得到番茄和馬鈴薯CIPK3基因的啟動子區(qū)及上游序列。順式元件預(yù)測采用PlantCARE軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/ plant care/ html/）進(jìn)行在線分析。亞細(xì)胞定位預(yù)測在WoLFPSORT （http：//wolfpsort.org/） 中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄和馬鈴薯CIPK3基因及其分子特征

利用比較基因組學(xué)的方法，分別從番茄和馬鈴薯基因組中鑒定出2個CIPK3基因，分別命名為SlCIPK3.1， SlCIPK3.2， StCIPK3.1和StCIPK3.2（表1）。馬鈴薯的2個CIPK3基因都位于馬鈴薯1號染色體上，編碼大小分別為1 320，1 317 bp；而番茄的CIPK3基因分別位于1號和11號染色體上，編碼區(qū)大小均為1 314 bp。從基因結(jié)構(gòu)示意圖來看，馬鈴薯和番茄CIPK3的外顯子數(shù)均為14，編碼區(qū)大小相似，但是基因組序列番茄明顯大于馬鈴薯（圖2）。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，番茄和馬鈴薯CIPK3基因的編碼產(chǎn)物均定位在細(xì)胞膜上。馬鈴薯的2個CIPK3基因的核苷酸序列一致性為97.20%，編碼蛋白的序列一致性為97.27%；而番茄的2個CIPK3基因的核苷酸序列一致性為85.88%，編碼蛋白的序列一致性為88.36%。遺傳進(jìn)化和Blatsp分析發(fā)現(xiàn)，它們均與擬南芥的CIPK3直系同源（圖1）。StCIPK3.1和StCIPK3.2與AtCIPK3編碼蛋白序列一致性分別為78.54%，77.88%，而SlCIPK3.1和SlCIPK3.2與AtCIPK3編碼蛋白的的序列一致性分別為79.82%，79.60%。蛋白基序分析發(fā)現(xiàn)，StCIPK3.1和StCIPK3.2含有的蛋白基序類型相同，二者均含有1個酰胺化位點，3個N-糖基化位點，2個N-豆蔻?；稽c，1個ATP結(jié)合區(qū)，1個核定位信號，1個CIPK家族特有的NAF結(jié)構(gòu)域；不同的是，StCIPK3.1含有3個蛋白激酶磷酸化位點，而StCIPK3.2含有4個磷酸化位點。番茄的2個CIPK3基因編碼的蛋白含有基序的種類一樣，含有基序的數(shù)目除了豆蔻?；稽c和蛋白激酶C磷酸化位點不一樣之外，其余均相同（表2）。

2.2 番茄和馬鈴薯CIPK3順式調(diào)控元件和功能預(yù)測

順式調(diào)控元件分析表明，番茄和馬鈴薯CIPK3基因上游序列中均含有多個逆境和激素應(yīng)答順式調(diào)控元件，StCIPK3.1分別含有一個ABA應(yīng)答元件，1個冷脅迫應(yīng)答元件，1個干旱應(yīng)答元件，3個赤霉素應(yīng)答元件，1個水楊酸應(yīng)答元件和2個逆境及防衛(wèi)應(yīng)答元件；StCIPK3.2分別含有1個乙烯應(yīng)答元件和水楊酸應(yīng)答元件，4個赤霉素應(yīng)答元件，2個熱脅迫應(yīng)答元件HSE，2個干旱應(yīng)答元件，3個逆境及防衛(wèi)應(yīng)答元件；SlCIPK3.1 分別含有1個乙烯應(yīng)答元件，2個干旱應(yīng)答元件，6個赤霉素應(yīng)答元件，2個逆境和防衛(wèi)應(yīng)答元件，2個水楊酸應(yīng)答元件2個創(chuàng)傷及病原物應(yīng)答元件；SlCIPK3.1 分別含有1個脫落酸應(yīng)答元件，5個赤霉素應(yīng)答元件，3個干旱應(yīng)答元件，1個逆境和防衛(wèi)應(yīng)答元件，1個創(chuàng)傷及病原物應(yīng)答元件。表明它們調(diào)控的逆境應(yīng)答過程可能有所不同。已有研究表明，擬南芥的CIPK3基因參與ABA信號、冷脅迫應(yīng)答、細(xì)胞內(nèi)鎂離子的平衡及鎂離子過量脅迫下的生長發(fā)育過程。 根據(jù)擬南芥CIPK3的研究結(jié)果和番茄、馬鈴薯CIPK3順式元件分析結(jié)果，推斷番茄和馬鈴薯的CIPK3基因在逆境應(yīng)答過程中具有多種功能。

3 結(jié) 論

本研究分別從番茄和馬鈴薯基因組中鑒定出2個與擬南芥CIPK3直系同源的基因，其序列一致性高達(dá)85%以上；在基因結(jié)構(gòu)上一致，都有14個外顯子，而且各外顯子的大小和排列順序基本一致。在編碼蛋白的結(jié)構(gòu)方面十分相似，含有的蛋白基序類型一致，而且不同基序的數(shù)目幾乎完全一樣，但它們在上游順式調(diào)控元件方面差異較大。說明它們在基因結(jié)構(gòu)上十分保守，但是也存在功能上的分化。筆者據(jù)此推測，番茄和馬鈴薯的CIPK3可能具有多樣的生物學(xué)功能，能夠參與多個相似和不同的逆境及激素應(yīng)答過程。至于番茄和馬鈴薯CIPK3基因的具體功能如何，還需進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊帥， 閔凡祥， 高云飛， 等.新世紀(jì)中國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及存在問題[J].中國馬鈴薯， 2014（5）： 311-316.

[2]周真珍， 徐明， 李力. 馬鈴薯分子抗性育種研究進(jìn)展[J]. 作物研究， 2015， 29： 550-554.

[3]姜麗麗， 吳立萍， 牟芮， 等. 不同用途馬鈴薯離體條件下耐鹽性鑒定[J]. 作物雜志， 2015（6）： 59- 63.

[4]劉芳， 王培倫， 楊元軍， 等. 不同馬鈴薯品種對鹽脅迫反應(yīng)的差異研究[J]. 西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2010， 32（10）： 47-53.

[5]張景云， 繆南生， 趙萍， 等. 馬鈴薯耐鹽性的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報， 2011， 47 （11）： 1047-1052.

[6]張景云， 繆南生， 白雅梅， 等. 二倍體馬鈴薯耐鹽品種鑒定的生理指標(biāo)測定[J]. 植物生理學(xué)報， 2013， 49 （9）： 889-894.

[7]劉思妍， 毛娟， 范阿棋， 等. 馬鈴薯StSnRK2基因克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 生物技術(shù)通報， 2013（3）： 83-89.

[8]張寧， 司懷軍， 栗亮， 等. 轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因馬鈴薯的抗旱耐鹽性[J]. 作物學(xué)報，2009， 35（6）： 1146-1150.

[9]郭鵬， 張士剛， 金華， 等. 番茄脫水素基因 SlDHN2b 的克隆與表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報， 2012， 39（10）： 2015-2022.

[10]孫玉燕， 劉磊， 鄭崢， 等. 番茄耐旱和耐鹽遺傳改良的研究進(jìn)展及展望[J]. 園藝學(xué)報， 2012，39（10）： 2061-2074.

[11]HSIEH T H， LI C W， SU R C， et al. A tomato bZIP transcription factor， SlAREB， is involved in water deficit and salt stress response[J]. Planta， 2010， 231（6）： 1459-1473.

[12]湯湖斌， 閔康康， 徐玲玲， 等. CBL-CIPKs信號系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報， 2015， 37（1）： 100-105.

[13]KLEIST T J， SPENCLEY A L， LUAN S. Comparative phylogenomics of the CBL-CIPK calcium-decoding network in the moss Physcomitrella， Arabidopsis， and other green lineages[J]. Front plant sci， 2014， 5： 187.

[14] DE LA TORRE F， GUTI？RREZ-BELTR？N E， PAREJA-JAIME Y， et al. The tomato calcium sensor Cbl10 and its interacting protein kinase Cipk6 define a signaling pathway in plant immunity[J]. Plant cell， 2013， 25（7）： 2748-2764.

[15]HUANG C， DING S， ZHANG H， et al. CIPK7 is involved in cold response by interacting with CBL1 in Arabidopsis thaliana[J]. Plant science， 2011， 181（1）： 57-64.

[16]PANDEY G K， KANWAR P， SINGH A， et al. CBL-interacting protein kinase， CIPK21， regulates osmotic and salt stress responses in Arabidopsis[J]. Plant physiology， 2015， 169（1）： 780-792.

[17]LYZENGA W J， LIU H， SCHOFIELD A， et al. Arabidopsis CIPK26 interacts with KEG， components of the ABA signalling network and is degraded by the ubiquitin-proteasome system[J]. J exp bot， 2013， 64（10）： 2779-2791.

[18]KIM K N， CHEONG Y H， GRANT J J， et al. CIPK3， a calcium sensor-associated protein kinase that regulates abscisic acid and cold signal transduction in Arabidopsis[J]. Plant cell， 2003， 15（2）： 411-423.

[19]LIU L L， REN H M， CHEN L Q， et al. A protein kinase， calcineurin B-like protein-interacting protein Kinase9， interacts with calcium sensor calcineurin B-like Protein3 and regulates potassium homeostasis under low-potassium stress in Arabidopsis[J]. Plant physiol， 2013， 161（1）： 266-277.

[20]HU H C， WANG Y Y， TSAY Y F. AtCIPK8， a CBL-interacting protein kinase， regulates the low-affinity phase of the primary nitrate response[J]. Plant journal， 2009， 57（2）： 264-278.

[21]Tang R J， Zhao F G， Garcia V J， et al. Tonoplast CBL-CIPK calcium signaling network regulates magnesium homeostasis in Arabidopsis[J]. Proc natl acad sci U S A. 2015， 112（10）： 3134-3139.

[22]Steinhorst L， Mhs A， Ischebeck T， et al. Vacuolar CBL-CIPK12 Ca（2+）-Sensor-Kinase complexes are required for polarized pollen tube growth[J]. Current biology， 2015， 25（11）： 1475-1482.

[23]ZHOU L， LAN W， CHEN B， et al. A calcium sensor-regulated protein kinase， CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN-INTERACTING PROTEIN KINASE19， is required for pollen tube growth and polarity[J]. Plant physiology， 2015， 167（4）： 1351-1360.

[24]MOGAMI J， FUJITA Y， YOSHIDA T， et al. Two distinct families of protein kinases are required for plant growth under high external Mg2+ concentrations in Arabidopsis[J]. Plant physiology， 2015， 167（3）： 1039-1057.

[25]Pandey G K， Grant J J， Cheong Y H， et al. Calcineurin-B-like protein CBL9 interacts with target kinase CIPK3 in the regulation of ABA response in seed germination[J]. Molecular plant， 2008， 1（2）： 238-248.

[26]The Potato Genome Sequencing Consortium. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato[J]. Nature， 2011， 475： 189-196.

[27]Tomato Genome Consortium. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution[J]. Nature， 2012， 485： 635-641.

[28]劉輝， 王濤濤， 張俊紅， 等. 番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAC80的克隆及表達(dá)分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報， 2015， 30（1）： 77-83.

[29]鄭州元， 林海榮， 崔輝梅. 外源硫化氫對鹽脅迫下加工番茄幼苗生理生化特性的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報， 2017， 32 （1）： 208-214.

[30]鄧珍， 徐建飛， 段紹光， 等. PEG-8000模擬干旱脅迫對11個馬鈴薯品種的組培苗生長指標(biāo)的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報， 2014， 29 （5）： 99-106.