郭 琳，柴志欣，鐘金城，陳智華

(1.西南民族大學 動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學 青藏高原研究院，成都 610041)

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牦牛 DKK1基因多態(tài)性及其與生長性狀的相關性

郭 琳1,2，柴志欣1,2，鐘金城1,2，陳智華1

(1.西南民族大學 動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學 青藏高原研究院，成都 610041)

選取麥洼牦牛、類烏齊牦牛、申扎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛5個群體共287頭個體，采用直接測序法檢測牦牛 DKK1基因的SNP位點，分析其與生長性狀的相關性。結果表明，牦牛 DKK1基因存在2個突變位點， g.983A→G位點和g.1075C→G位點；位點g.983A→G在斯布牦牛中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，其余位點處于平衡狀態(tài)。在遺傳多態(tài)性研究中，2個SNP位點均為中度多態(tài)。2個位點不同基因型與體高、體斜長、胸圍、管圍和體質量的相關分析結果顯示，位點g.983A→G與體高、體斜長、胸圍和體質量均具有相關性；位點g.1075C→G與生長性狀不相關。

牦牛； DKK1基因；單核苷酸多態(tài)性(SNP)；相關性

牦牛是中國青藏高原的特有物種，生活在海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)，晝夜溫差大，輻射強，牦牛具有耐寒、抗低氧等特征，對高山草地生態(tài)環(huán)境具有極強的適應性，是經長期自然選擇而形成的優(yōu)勢群體，具有獨特的體質形態(tài)結構和生理特征，在遺傳上是一個優(yōu)質的基因庫[1]。牦牛作為一個全能型的優(yōu)勢資源，其肉質性狀和生長性狀是選育工作的重要方面，由于粗放式經營和不健全的良種體系影響牦牛群體生產力，具體表現為體格小、體質量降低等。1998年Glinka等[2]首次在非洲爪蟾胚胎細胞中發(fā)現Dickkopf-1 ( DKK1)基因，是Dickkopf(DKKs)家族成員之一，Wnt/β-catenin信號是調節(jié)骨代謝及維持骨質穩(wěn)態(tài)的主要信號途徑，DKK1作為一種可溶性Wnt抑制劑，可通過阻斷骨細胞分化并調節(jié)成骨細胞Wnt經典途徑的正性及負性調節(jié)因子即OPG與RANKL的平衡參與破骨的發(fā)生[3]。抗DKK1抗體可增加成骨細胞數量、降低破骨細胞數量而促進骨質形成[4]。牦牛肉質性狀和生長性狀是選育工作的參考指標， DKK1基因在骨骼發(fā)育和骨平衡中起重要作用，是骨再塑的重要調控因子。因此，本研究利用分子生物學和生物信息學技術研究牦牛 DKK1基因的遺傳多態(tài)性及其與體尺、體質量等生長性狀的關聯性，尋找與生產性能相關的多態(tài)位點，以期在育種實踐中提高牦牛的生產性能。

Dickkopf蛋白家族是一個保守的基因家族，也是構成Wnt拮抗劑的重要成分之一，包括DKK1、DKK2、DKK3和DKK4 4個成員[5]。 DKK1蛋白是一種外泌型的糖蛋白，可作為抑制劑參與調控Wnt信號[6]。DKK1作為Wnt抗結劑參與Wnt/β-catenin信號通路轉導[7]，Reya等[8]研究表明DKK1拮抗Wnt/β-catenin信號的主要原因是LRP5/6(Lowdensity lipoprotein receptor-related protein5/6)具有專門為Wnt/β-catenin信號通路轉導的特異性，結合特定的Wnt抑制，觸發(fā)某些特定的Wnt信號分子，從而調控骨骼發(fā)育和脂肪分化[9]。kremen1/2(krm1/2)作為DKK1的另一個高親和性受體，在 krm2 存在的情況下，DKK1可與 LRP6 、 Krm2 形成三元復合內吞小體，Mao等[10]研究表明，由于這種內吞現象的存在，可清除膜表面的 LRP6，從而抑制 Wnt/β-catenin 信號，影響胚胎發(fā)育及生長。Kazaskoya[11]研究顯示，DKK1 在非洲爪蟾胚胎發(fā)育過程中阻斷 Wnt信號，是頭部發(fā)育和脊索前板形成的必要條件。目前，對 DKK1基因多態(tài)性的研究主要集中在人、豬和秦川牛上，對于牦牛 DKK1基因的研究尚少， DKK1基因與牦牛體型密切相關，是選育工作的重要方面。本研究通過直接測序方式，對牦牛 DKK1基因全序列進行SNPs位點的篩選，尋找與其生長性狀相關的多態(tài)性位點，為提高牦牛生產性能提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取麥洼牦牛(MW)、類烏齊牦牛(LWQ)、申扎牦牛(SZ)、帕里牦牛(PL)和斯布牦牛(SB)5個品種共287頭個體，其中MW 97頭選于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣龍日種畜場，LWQ 49頭選于西藏自治區(qū)類烏齊縣，SZ 70頭選于那曲地區(qū)申扎縣，PL 31頭選于亞東縣帕里地區(qū)，SB 40頭選于墨竹工卡縣斯布村。采集牦牛耳組織樣品，φ=75%乙醇保存帶回實驗室，-80 ℃保存，備用，在樣品采集的同時測定其體高、體斜長、胸圍、管圍、體質量等生長指標。數據用“平均數±標準差”表示。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒(Axygen公司)；胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸出粉(Oxoid公司)，DL2000 Marker購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為成都科龍化工試劑廠產品。

1.3 基因組DNA提取

利用組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取基因組DNA[12]，采用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，置于-20 ℃保存，備用。

1.4 構建DNA池

DNA混合池是把多個DNA樣本溶液等質量濃度等體積混合，進行PCR擴增，主要用于基因分型，并用統計學方法對數據進行分析。這種方法有效地減少工作量，降低研究成本[13]。隨機選取80 個DNA樣品于4 ℃保存，使其單個樣品混勻，利用紫外分光光度計對DNA樣品質量濃度(上層、中層、下層)依次測定，取平均值。將每個樣品稀釋至50 ng/μL，各取5 μL混合，4 ℃環(huán)境下靜置24～48 h使其充分混勻，置于-20 ℃保存，備用。按照以上方法構建牦牛群體DNA池。

1.5 引物設計與合成

參考NCBI數據庫GenBank中牛(AC_000183) DKK1基因序列，采用交叉重疊原理，用Primer Premier 6.0軟件設計2對引物(表1)，引物由上海伯津生物技術有限公司合成。

1.6 PCR擴增

PCR反應體系(50 μL)：DNA模板2 μL，上下游引物各2 μL， dd H2O 19 μL、Premix ExTaq聚合酶25 μL。DKK1-1 PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 變性30 s，62.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。DKK1-2 PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 10 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 牦牛 DKK1基因的PCR擴增

DKK1-1擴增產物為大于2 000 bp的DNA片段，與預期的2 389 bp DNA片段長度一致。DKK1-2擴增產物長1 000～2 000 bp，靠近2 000 bp，與預期擴增的1 746 bp片段長度基本一致(圖1)。將擴增產物送英濰捷基(上海)生物技術有限公司測序，利用DNAMAN將測序結果與NCBI牛 DKK1基因序列進行比對，一致性為99.64%，確定為目的基因。利用BioEdit 7.0.5生物軟件查找雙峰位點，預測多態(tài)位點。

表1 擴增牦牛 DKK1基因序列所用引物信息Table 1 Information of primer to amplify complete yak DKK1 gene

2.2 牦牛 DKK1基因測序

DNA池PCR擴增產物測序結果顯示，牦牛 DKK1基因存在2個單核苷酸突變位點(圖2)，均位于內含子中(g.983A→G、g.1075C→G)。

2.3 DKK1基因SNPs位點的篩查和檢測

2個SNP位點PCR擴增測序結果表明，均含有3種不同的基因型，g.983A→G位點包括AA、AC、CC 3種基因型，g.1075C→G位點基因型為CC、CG和GG(圖3)。

圖1 牦牛 DKK1基因的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophpresis of PCR amplified DKK1 gene in yak

2.4 牦牛 DKK1基因的遺傳多態(tài)性

2.4.1 基因型頻率、基因頻率及χ2適合性檢驗 由表2可知，在g.983A→G位點中，雜合基因型AC在MW、PL和SB群體中的分布頻率為0.42、0.48和0.63，為優(yōu)勢基因型；CC基因型在LWQ和SZ中的分布頻率為均為0.49，為優(yōu)勢基因型。在g.1075C→G位點中，CC基因型在MW、SZ和SB中的分布頻率為0.56、0.60和0.65，為優(yōu)勢基因型；雜合基因型CG在LWQ和PL中分布頻率為0.41和0.55，為優(yōu)勢基因型。g.983A→G位點中，等位基因C基因頻率在5個群體中分別為0.6、0.68 、0.71、0.47和0.66，除在PL中不是優(yōu)勢等位基因外，在其余4個群體中均為優(yōu)勢等位基因；g.1075C→G位點中，等位基因C分布頻率為0.73、0.55、0.76、0.63和0.79，為優(yōu)勢等位基因。

圖2 牦牛 DKK1基因DNA池部分測序Fig.2 The results of sequencing of DKK1 fragment in yak

圖3 牦牛 DKK1基因2個SNP位點測序Fig.3 Sequencing of 2 SNP sites in DKK1 fragment of yak

表2 牦牛 DKK1基因2個SNP位點基因型頻率和基因頻率Table 2 Genotype allele and frequencies of 2 SNP sites in DKK1gene of yak

對牦牛 DKK1基因2個SNP位點進行卡方適合性檢驗(表3)，位點g.983A→G在SB中χ2值為6.324 2，達到顯著水平(P<0.05)，不符合Hardy-Weinberg平衡，群體遺傳不平衡，可能研究選取的牦牛個體數量較少，或是受到基因突變、人為選育等多種因素影響導致[14]。其余位點χ2值均未達到顯著水平(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡，在其長期進化過程中達到群體基因遺傳平衡。

2.4.2 群體遺傳多態(tài)性 運用PIC_CALC軟件計算多態(tài)信息含量，其中PIC>0.5高度多態(tài)，0.25

表3 牦牛 DKK1基因2個SNP位點的Hardy-Weinberg平衡性檢測Table 3 Equilibrium analysis of Hardy-Weinberg for 2 SNP sites in DKK1 gene of yak

表4 麥洼牦牛 DKK1基因2個SNP位點的遺傳多態(tài)性Table 4 Genetic polymorphism of 2 SNP sites of DKK1 gene in yak

2.4.3 DKK1基因多態(tài)性與牦牛生長性狀的關聯性分析

運用SPSS 17.0分析軟件中的單因素方差分析對276頭牦牛個體 DKK1基因的2個SNP位點不同基因型與體高、體斜長、胸圍、管圍和體質量等生長性狀進行相關性分析(表5～表6)。分析結果顯示，位點g.983A→G與體高、體斜長、胸圍和體質量均具有相關性(P<0.05)。AA基因型個體體高、體斜長、胸圍和體質量顯著高于AC基因型和CC基因型。位點g.1075C→G與生長性狀不相關，無統計學差異(P>0.05)。

表5 DKK1基因g.983A→G位點與牦牛生長性狀的相關性Table 5 Correlation analysis between the g.983A→G site and growth traits of yak

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note：The different scripts mean significant difference(P<0.05).

表6 DKK1基因g.1075C→G位點與牦牛生長性狀的相關性Table 6 Correlation analysis between the g.1075C→G site and growth traits of yak

3 討 論

在非洲爪蟾胚胎早期發(fā)育的研究中發(fā)現 DKK1能夠誘導頭部發(fā)育和脊索前板形成[2]，在斑馬魚[16]胚胎發(fā)育過程中尤其是感應區(qū)頭部的表達中 DKK1起關鍵作用，去除 DKK1基因的小鼠表現出嚴重的肢體發(fā)育異常，從而證實 DKK1在肢體發(fā)育和骨平衡中起著重要作用[17-19]。高建斌等[20]對秦川牛 DKK1基因進行SNPs篩查，發(fā)現存在5個突變位點，分別為第1內含子G523A突變，第2內含子A999G 和A1169G突變，第3內含子C1858T突變和第4外顯子A2355G突變，其中G523A、A999G、A1169G和C1858T位點均位于內含子區(qū)域，均不編碼蛋白質序列，但其功能機制尚不清楚。曹貴玲[21]對白絨山羊群體 DKK1基因序列進行多態(tài)位點掃描，發(fā)現33處單核苷酸替代，內含子2中存在1處4堿基插入，啟動子區(qū)T593C-C603A位點，T-C顛換和C-A轉換，二者間距9 bp，單位體表面積產絨量、產絨量、出生質量、斷奶增質量等性狀在T593C位點不同基因型之間差異不顯著。欒新[22]對兔 DKK1基因進行相關研究，結果顯示 DKK1基因與毛囊發(fā)育有著密切關聯，并通過銀染技術和酰胺凝膠電泳相結合的試驗方法，發(fā)現2種基因型，但這2種基因型與毛長、皮張面積、光澤度、平整度和毛密度5個兔被毛性狀的相關上均差異不顯著(P>0.05)。

本研究采用DNA直接測序技術對麥洼牦牛、類烏齊牦牛、申扎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛 DKK1基因進行SNPs篩選，結果發(fā)現2個SNP位點，g.983A→G位點包括AA、AC、CC 3種基因型，g.1075C→G位點基因型為CC、CG和GG，具有較豐富的遺傳變異。2個SNP位點中，CC為優(yōu)勢基因型， g.983A→G位點中等位基因C基因頻率在5個群體中分別為0.60、0.68 、0.71、0.47和0.66，除在帕里牦牛中不是優(yōu)勢等位基因外，在其余4個類群中均為優(yōu)勢等位基因；g.1075C→G位點中等位基因C為優(yōu)勢等位基因?；蝾l率的差異在各群體間較為顯著，群體間的遺傳距離相對較大。位點g.983A→G在斯布牦牛中χ2值為6.324 2，達到顯著水平(P<0.05)，不符合Hardy-Weinberg平衡，群體遺傳不平衡，可能受到基因突變、人為選育等多種因素影響導致，說明其在自然選擇和人工選育過程中可能會被逐漸淘汰[23]，也可能與品種本身有關或是由于樣本量過小導致群體的等位基因頻率和基因型頻率改變；其余位點χ2值均未達到顯著水平(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡，在其長期進化過程中達到群體基因遺傳平衡。2個SNP位點分布均為中度多態(tài)，PIC越高，雜合度越大，遺傳變異也較為豐富，在以往的選擇中受到的壓力較小，選擇空間大，在育種實踐中，可加大人工選擇的強度。運用SPSS17.0分析軟件對牦牛 DKK1基因的2個SNP位點不同基因型與牦牛體高、體斜長、胸圍、管圍和體質量等生長性狀進行相關性分析，分析結果顯示位點g.983A→G與體高、體斜長、胸圍和體質量均具有相關性(P<0.05)，AA基因型個體體高、體斜長、胸圍和體質量顯著高于AC基因型和CC基因型，由此表明，g.983A→G位點的等位基因A可能影響牦牛體尺性狀；位點g.1075C→G與生長性狀不相關，無統計學差異(P>0.05)。與高建斌等[20]對秦川牛 DKK1基因研究結果一致，其研究結果表明 DKK1基因可能對秦川牛體斜長、體高、腰高、尻長和坐骨端寬的體尺性狀有顯著影響。牦牛 DKK1基因g.983A→G位點可作為影響體高、體斜長、胸圍和體質量的遺傳標記，可以通過對優(yōu)勢基因型的選擇，加快牦牛育種的遺傳改良[24]。 DKK1影響骨骼的形成和發(fā)育，相關性狀已經在小鼠身上得到證實。目前該基因在大型家畜的研究較少，在高建斌[20]對秦川牛的研究中證明該基因不但對部分體尺性狀有影響，在肉質性狀方面也存在顯著差異。因此未來對 DKK1基因相關性狀的研究應擴大到更多的大型家畜上，獲得更多經濟效益。

4 結 論

牦牛 DKK1基因存在一定的遺傳多態(tài)性，在其內含子區(qū)域處篩選出2個SNP位點，分別為g.983A→G和g.1075C→G位點，且位點g.983A→G對牦牛的體高、體斜長、胸圍和體質量有較為顯著的影響，可以用來作為優(yōu)化選育體系的一種遺傳標記。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Association of Single Nucleotide Polymorphism of DKK1 Gene with Growth Traits in Yak.

GUO Lin1,2,CHAI Zhixin1,2,ZHONG Jincheng1,2and CHEN Zhihua1.

(1.Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry ofEducation,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 2.Institute of Tibetan Plateau Research,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

To investigate the genetic polymorphism of Dickkopf-1 ( DKK1) gene in yak and reveal the association between SNPs detected and growth traits,and looking for alternative auxiliary marker. This study selected 287 individuals which include five yak breeds named Maiwa,Leiwuqi ,Shenzha ,Pali and Sibu,to detect the SNPs of the DKK1 gene in yaks and its correlation with the growth traits of yak. The results showed that:there are two mutations in the DKK1 gene,each of them has three different genotypes. The χ2value of g.983A→G site in SB yak was 6.324 2,which meant the site was out-off-balance of the Hardy-Weinberg equilibrium (HWE),but the rest of sites matched the balance of the HWE;the distribution of both SNPs were moderate polymorphic;the correlation analysis between different genotypes of two SNPs of DKK1 gene and body height,body length,chest bust,cannon circumference,body mass and other growth traits showed that g.983A→G site was associated with body height,body length,chest bust,and body mass,but no significant difference was detected between g.1075C→G and growth traits.

Yak; DKK1 gene; Single nucleotide polymorphism (SNP); Correlation Analysis

2015-11-16 Returned 2016-03-06

The National Science and Technology Support Program Topic(No.2012BAD03B02)；Southwest University for Nationalities Construction Graduate Student Enrollments Projects (No.20152XWD-S071007).

GUO Lin,female,master student. Research area:molecular ecology.E-mail:guolin20151@163.com

CHEN Zhihua,male,professor,Ph.D.Research area:bio-diversity.E-mail:Chenzhihua_czh@sohu.com

日期：2017-06-29

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1107.014.html

2015-11-16

2016-03-06

國家科技支撐計劃(2012BAD03B02)；西南民族大學研究生學位點建設項目(20152XWD-S071007)。

郭 琳，女，碩士研究生，研究方向為分子生態(tài)學。E-mail:guolin20151@163.com 通信作者：陳智華，男，教授，博士，研究方向為生物多樣性。E-mail：Chenzhihua_czh@sohu.com 鐘金城，男，教授，研究方向為動物遺傳學。E-mail：zhongjincheng518@163.com

S823；Q78

A

1004-1389(2017)07-0975-08

ZHANG Jincheng,male,professor.Research area:animal genetics.E-mail:zhongjincheng518@163.com