李衛(wèi)芳，張 亞，肖 斌 ，陳良超，冉隆貴

(西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

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漢中仙毫香氣成分分析與評價

李衛(wèi)芳，張 亞，肖 斌 ，陳良超，冉隆貴

(西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

選用陜西漢中6個茶葉主產(chǎn)縣12個具有代表性的漢中仙毫樣品，采用頂空-固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用法(HS-SPME-GC-MS)共鑒定出85種香氣成分。采用聚類分析，將樣品分為3類。通過主成分分析，并建立漢中仙毫香氣質(zhì)量評價模型。結(jié)果表明：漢中仙毫的特征性香氣成分有芳樟醇氧化物I、芳樟醇、(-)-α-蓽澄茄油烯、茉莉酮、肉豆蔻酸乙酯、13-甲基十四烷酸乙酯、丁基十四烷基酯、棕櫚酸乙酯、十五酸乙酯9種芳香物質(zhì)，所構(gòu)建的香氣評價模型評判的結(jié)果與感官審評結(jié)果有較好的一致性。綜合評價樣品香氣品質(zhì)排序為C類(采自南鄭和城固)>A類(采自西鄉(xiāng)和鎮(zhèn)巴)>B類(采自南鄭和城固)。

漢中仙毫；香氣成分；頂空-固相微萃取法(HS-SPME)；氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)；聚類分析；主成分分析

漢中仙毫是具有國家地理標志的產(chǎn)品之一，也是漢中市茶葉區(qū)域公用品牌。為了改變漢中市茶葉品牌繁多、亂、雜，市場知名度較低，產(chǎn)品競爭力較弱的局面，漢中市政府在2005年開始著手茶葉品牌的整合工作，將原有的午子仙毫、寧強雀舌、定軍茗眉、秦巴霧毫和漢水銀梭等20多個茶葉品牌，實行“統(tǒng)一品名，統(tǒng)一工藝，統(tǒng)一標準”，整合為一個品牌，即漢中仙毫[1]。漢中市位于陜西省南部，地處南北氣候過度地帶，秦嶺巴山環(huán)抱的漢水上游，四季分明、雨水充沛、陽光充足、土壤適宜，屬濕潤性季風氣候，是地球上同緯度生態(tài)環(huán)境最好的地區(qū)[2-3]。漢中具有得天獨厚的自然地理氣候條件，產(chǎn)茶歷史悠久，出產(chǎn)的茶葉品質(zhì)優(yōu)良[4]。使得漢中仙毫具有“香高、味濃、形美、耐泡、保健”五大特點[1]。對漢中仙毫的研究，大多局限于加工工藝改良[5-6]和內(nèi)含成分分析[7-10]等，對香氣成分的研究報道[11-12]相對較少。

茶葉香氣是形成茶葉風味特征、決定茶葉價值的重要指標[13]。目前，在綠茶香氣組分中已分離鑒定出300余種[14]。香氣成分提取方法主要有減壓蒸餾法、同時蒸餾萃取法、頂空分析法、超臨界CO2萃取法、固相微萃取法等[14]；定性方法主要有GC-MS、全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(GC×GC-TOFMS)、GC-O[15]；定量方法有歸一法、外標法和內(nèi)標法[16]。

茶香品質(zhì)的判定多采用感官審評[17]，其結(jié)果主觀性強，個體差異明顯，且易受環(huán)境、情緒、工作程序等諸多因素影響，依據(jù)香氣含量及成分的差異進行區(qū)分鑒定鮮有報道。隨著科技的快速發(fā)展，茶葉香氣物質(zhì)的研究有了較快的發(fā)展，但由于香氣物質(zhì)在茶葉中相對含量低(僅0.1%左右)、成分多、易揮發(fā)，提取過程中易發(fā)生多種反應等[13-14]。茶葉香氣的研究仍存在許多亟待解決的問題，需要進一步深入研究。為進一步研究漢中仙毫內(nèi)在香氣品質(zhì)及為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供理論依據(jù)，本試驗采用頂空-固相微萃取方法(HS-SPME)對12個仙毫樣品的香氣物質(zhì)進行提取，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS)進行定性分析、峰面積歸一法進行定量分析，通過聚類分析將樣品進行分類，采用主成分分析，將樣品復雜的香氣信息簡單化，進而研究漢中仙毫香氣物質(zhì)中的主要特征性成分，并構(gòu)建香氣評價模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：12個試驗茶樣取自陜西漢中6個茶葉主產(chǎn)縣，樣品L1～L2來自西鄉(xiāng)，L3～L4鎮(zhèn)巴，L5～L6寧強，L7～L8勉縣，L9～L10南鄭，L11～L12城固，生產(chǎn)日期為2015年4月。試劑：無水硫酸鈉(國產(chǎn)分析純) C8～C20偶數(shù)位正構(gòu)烷烴標樣(AccuStandard)。

1.2 儀 器

ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；磁力攪拌器，美國TALBOYS公司；CNW 24-400 40 mL EPA樣品瓶，上海安譜科學儀器有限公司；DB-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)手動SPME進樣器和DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；AL204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 感官審評方法 稱取茶樣3.0 g于150 mL沸水沖泡5 min，由3名專業(yè)品評師密碼審評，一手持杯，一手持蓋，靠近鼻孔，半開杯蓋，嗅評從杯中散發(fā)出來的香氣，每次持續(xù)2～3 s后，隨即合上杯蓋。反復1～2次，并熱嗅(杯溫約75 ℃左右)、溫嗅(杯溫約45 ℃左右)、冷嗅(杯溫接近室溫)結(jié)合進行。從香氣類型、濃度、純度、持久性評定香氣，給出評分[17]。

1.3.2 樣品處理 取茶樣10 g，加液氮研磨，過40目篩，用錫箔紙密封，保存于-20℃冰箱中。

1.3.3 頂空固相微萃取法提取揮發(fā)性成分 稱取5 g磨碎茶樣于15 mL萃取瓶中，依次加入2 g Na2SO4、磁力轉(zhuǎn)子、5 mL沸騰蒸餾水，錫箔紙封口，置于磁力攪拌器上。70 ℃水浴下平衡10 min，頂空萃取30 min后，于氣相色譜儀進樣口250 ℃解析3 min。

1.3.4 GC-MS條件 氣相色譜條件：DB-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度為250 ℃；傳輸線230 ℃；柱溫起始為40 ℃，保持2.5 min，以3 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持3 min；載氣為高純氦氣，純度>99.999%，流速1 mL/min；不分流進樣。

質(zhì)譜條件：離子源EI，電子能量70 eV，離子源溫度240 ℃，四極桿溫度240 ℃，轉(zhuǎn)接口溫度240 ℃，質(zhì)量掃描范圍為35～400 m/z。發(fā)射電流100 μA，檢測電壓1.4 kV。

1.3.5 保留指數(shù)測定 各香氣成分保留指數(shù)的計算公式如下：

RI=100n+200×(RTx-RTn)/ (RTn+2-RTn)

式中，RI是該物質(zhì)的保留指數(shù)；n是其緊鄰前一碳標的原子數(shù)；RTx是其保留時間；RTn是其緊鄰前一碳標的保留時間；RTn+2是其緊鄰后一碳標的保留時間。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 利用隨機Xcalibur工作站NIST2008標準譜庫自動檢索各組分(參考正反匹配度大于800)，參照文獻[5,11,12,18-24]及標準譜圖對機檢結(jié)果進行核對和確認，按面積歸一化法(組分峰面積占總峰面積的百分比)[5]計算各組分的相對含量。用Microsoft Excel 2007、SPSS 20.0、SIMCA-P+11對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 漢中仙毫主要香氣物質(zhì)組成

采用SPME富集揮發(fā)性化合物，進行GC-MS分析，根據(jù)正構(gòu)烷烴保留指數(shù)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)及參考文獻，12個樣品中共鑒定出85種揮發(fā)性化合物(表1)。由表1可知，所檢出的揮發(fā)性成分中，有醇類22種、醛類12種、酮類6種、酯類15種、萜烯類9種、烷烴類14種、芳香族類5種、烴類26種、酚類2種、酸類1種、甲氧基類化合物1種。

揮發(fā)性成分庚醛、芳樟醇、芳樟醇氧化物、3,4-二甲基苯甲醛、2,6,11-三甲基十二烷、茉莉酮、香葉基丙酮、2,6,10-三甲基十四烷、2,4-二叔丁基苯酚、肉豆蔻酸乙酯、鄰苯二甲酸庚烷-4-醇異丁酯、丁基十四烷基酯、棕櫚酸乙酯、十五酸乙酯在所有樣品中均檢測出，可看作仙毫揮發(fā)性物質(zhì)的基本組分。此外，揮發(fā)性成分棕櫚酸乙酯(9.13%～28.56%)、2,4-二叔丁基苯酚(4.32%～9.33%)、肉豆蔻酸乙酯(0.75%～3.12%)、十五酸乙酯(0.84%～3.03%)、茉莉酮(1.23%～8.03%)、3,4-二甲基苯甲醛(5.80%～19.83%)、芳樟醇(1.23%～4.68%)、香葉醇(0～2.76%)等在所檢出成分中比重較大，對仙毫香氣的形成有重要影響。

2.2 漢中仙毫聚類分析

通過SIMCA-P+11軟件對12個仙毫樣品進行層次聚類分析，圖1中，縱坐標表示通過計算所得樣本點間的距離。由圖1可知，樣品可以分為3類，設樣品L1～L4為A類，采自西鄉(xiāng)和鎮(zhèn)巴，L5～L8為B類，采自寧強和勉縣，L9～L12為C類，采自南鄭和城固。其中，西鄉(xiāng)和鎮(zhèn)巴接壤，當?shù)貧夂颦h(huán)境接近，加工工藝類似，寧強和勉縣、南鄭和城固亦是如此，由此可知，所選樣品香氣品質(zhì)具有顯著的地域性差異，這可能與當?shù)貧夂颦h(huán)境及加工工藝不同等有關(guān)。因此，聚類分析對漢中仙毫產(chǎn)地來源的分析研究有重要意義。

從分析結(jié)果(表1、圖2)可以看出，樣品揮發(fā)性物質(zhì)組成差異不大，但各物質(zhì)相對含量分布有較大差異。所鑒定出的各類化合物相對含量分別占其提取物總量的平均值為：A類(82.08 %)>C類(76.24%)>B類(73.64%)，其中醇類平均含量為C類(11.42%)>A類(11.05%)>B類(10.39%)；酯類C類(29.44 %)>A類(23.66%)>B類(18.69%)，碳氫化合物B類(15.27%)>A類(10.57%)>C類(6.31 %)，醛類B類(18.89%)>A類(13.61 %%)>C類(7.36%)，這幾類揮發(fā)性成分相對含量較高，是漢中仙毫揮發(fā)性物質(zhì)中的主要組分，發(fā)揮重要作用。

圖1 漢中仙毫樣品聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis in Hanzhong Xianhao green tea samples

圖2 漢中仙毫香氣組分對比結(jié)果Fig.2 Comparison of volatile constituents Hanzhong Xianhao green tea samples

2.3 主成分分析

1-戊烯-3-醇、羅勒烯、(E)-2-辛烯-1-醇、辛酸乙酯等僅在少量樣品中檢測出，并不能詮釋漢中仙毫普遍的香氣特征。因此本試驗選取12個茶樣的2/3即8個樣品均檢出44種芳香物質(zhì)，如表1、表2所示。為確定仙毫香氣的特征性成分，以12個茶樣共檢出的44種香氣物質(zhì)含量構(gòu)成12×44的矩陣，由SPSS 20.0軟件分析，按照剔除最小特征值的主成分中所對應最大特征向量的變量的原則，一次剔除一個變量，余下變量再進行主成分分析[24]。經(jīng)有限次剔除后保留9種香氣成分：芳樟醇氧化物I、芳樟醇、(-)-α-蓽澄茄油烯、茉莉酮、肉豆蔻酸乙酯、13-甲基十四烷酸乙酯、丁基十四烷基酯、棕櫚酸乙酯、十五酸乙酯。其中酯類5種，醇類2種，1種酮類和1種烯類。

表2 8種樣品共檢出的芳香物質(zhì)Table 2 The common aroma component detected in 8 or more tea samples

從由表3可知，前2個主成分的特征值大于1，第一主成分的方差貢獻率52.045%，第二主成分貢獻率33.915%，其累計貢獻率達85.961%，保留了原始變量的信息，所以提取前2個主成分分析。

由前2個主成分所對應的特征向量(表4)可知，第一主成分F1=-0.200X10-0.182X12-0.861X18-0.162X19+0.931X32+0.960X37-0.339X39+0.868X41+0.937X42，單獨說明所有茶樣在這9個香氣成分上總信息的52.045%，主要代表酯類和烯類；第二主成分F2=0.853X10+0.888X12-0.001X18+0.910X19+0.031X32+0.056X37-0.908X39-0.326X41-0.285X42，單獨說明所有茶樣在這9個香氣成分上總信息的33.915%，主要代表醇類和酮類，由此說明，以上9個香氣成分為漢中仙毫樣品的主要特征性香氣物質(zhì)。

表3 特征值與累計貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution ratio

以不同特征值的方差貢獻率βi(i=1,2…,k)為加權(quán)系數(shù)，利用綜合評價函數(shù)F=β1F1+β2F2+…+βkFk計算各樣本得分[25-26]，結(jié)果如表5所示。由模型計算的得分得出，茶樣L9香氣品質(zhì)最好，其次是茶樣L10和L12，再次是茶樣L1和L11，L2～L5相對較好，L6～L8相對較差。整體而言，3類茶葉香氣品質(zhì)排序為：C類>A類>B類，A類表現(xiàn)為嫩香，B和C類較為接近，大多表現(xiàn)為清香。對照傳統(tǒng)感官審批評分及評語可知，2種評價結(jié)果基本一致。這一結(jié)果進一步說明，用于主成分分析的9個香氣成分為漢中仙毫的主要特征性香氣物質(zhì)。

由主成分分析的結(jié)果，結(jié)合聚類分析(圖1)，表明12個仙毫樣品的香氣品質(zhì)和香型也被分離開?？梢?，聚類分析可以為漢中仙毫香氣品質(zhì)等級和香型的劃分提供較為科學的參考依據(jù)。

表4 前2個主成分特征向量Table 4 Eigenvector associated with the first 2 principal components

3 討 論

本試驗選用漢中3個茶樹種植面積較大、產(chǎn)量較高的產(chǎn)茶縣共12個漢中仙毫樣品，根據(jù)產(chǎn)地不同分為A類、B類、C類，其香氣成分涉及醇、酯、醛、酮、酚、酸等，同時芳香族化合物及萜烯類風味物質(zhì)等碳氫化合物存在較為豐富和廣泛，這與以往研究相符[5,11-12,18-21]。其中C類樣品醇類和酯類含量最高，A類次之，B類最低；碳氫化合物A類最高，醛類B類最高。參考主成分結(jié)果(香氣品質(zhì)C類>A類>B類)可知，醇類和酯類是漢中仙毫香氣形成的主導成分，其次是碳氫化合物等。

通過對2/3以上樣品中共同檢測出的44種香氣成分進行主成分分析，得出漢中仙毫9種主要香氣特征成分：氧化芳樟醇、芳樟醇、(-)-α-蓽澄茄油烯、茉莉酮、肉豆蔻酸乙酯、13-甲基十四烷酸乙酯、丁基十四烷基酯、棕櫚酸乙酯、十五酸乙酯；利用綜合評價函數(shù)F=β1F1+β2F2+…+βkFk對不同樣品香氣進行質(zhì)量評價，樣品香氣品質(zhì)C類>A類>B類，評價結(jié)果與傳統(tǒng)感官審評結(jié)果基本一致。結(jié)合聚類分析，漢中仙毫樣品的香氣品質(zhì)具有顯著地域性差異，聚類分析可以為其產(chǎn)地來源和香氣品質(zhì)等級的劃分提供較為科學的參考依據(jù)。

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(責任編輯：史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

Evaluation of Aroma Components in Hanzhong Xianhao Green Tea .

LI Weifang,ZHANG Ya,XIAO Bin,CHEN Liangchao and RAN Longgui.

(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

The aroma components of 12 representative Hanzhong Xianhao green tea samples from six major tea producing counties in Hanzhong, Shaanxi were extracted by HS-SPME and analyzed by GC-MS. About 85 different compounds were isolated and identified from samples. The samples are divided into three categories by cluster analysis. Based on principal component analysis, a model for evaluating aroma quality was established, the main components of Hanzhong green tea were linalool oxide I,linalool, à-cubebene,2-cyclopenten-1-one, 3-methyl-2-(2-pentenyl)-, (Z)-, tetradecanoic acid,phthalic acid,butyl tetradecyl ester,ethyl ester, Ethyl 13-methyl-tetradecanoate,phthalic acid, butyl tetradecyl ester,hexadecanoic acid, ethyl ester, pentadecanoic acid,ethyl ester.The evaluation result was basically consistent with conventional sensory evaluation.The aroma quality was in the order:category C>category A>category B．

Hanzhong Xianhao green tea；Volatile components；Head-space solid-phase micro-extraction(HS-SPME)；Gas chromatography-mass spectrometer(GC-MS)； Principal component analysis；Cluster analysis

2016-05-09 Returned 2016-05-25

National Tea Industry Technical System(No.CARS-23);Shaanxi Province Sciecne and Technology Co-ordination Project Problem Bidding(No.2013KTZB-02-01).

LI Weifang,female,master student.Research area:processing and aroma components of tea.E-mail:1219511294@qq.com

XIAO Bin,male,professor,master supervisor.Research area:physiological ecology of tea plant.E-mail:1647785720@qq.com

日期：2017-06-29

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1108.032.html

2016-05-09

2016-05-25

國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-23)；陜西省科技統(tǒng)籌工程計劃難題招標項目(2013KTZB-02-01)。

李衛(wèi)芳，女，碩士研究生，研究方向為茶葉加工及香氣成分。E-mail: 1219511294@qq.com 通信作者：肖 斌，男，教授，碩士生導師，主要從事茶樹生理生態(tài)研究。E-mail：1647785720@qq.com

TS272

A

1004-1389(2017)07-1068-09