孫文慶,康亞龍,劉建國,蔣桂英

(石河子大學(xué) 新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)

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加工番茄連作對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響

孫文慶,康亞龍,劉建國,蔣桂英

(石河子大學(xué) 新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)

通過在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站開展加工番茄連作(種植1 a、連作3 a、5 a和 7 a)定點(diǎn)微區(qū)試驗(yàn)，于花果期和成熟期采集根際土壤, 利用聚合酶鏈-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù), 分析不同連作年限加工番茄根際微生物結(jié)構(gòu)和多樣性的變化。結(jié)果表明， 隨著加工番茄連作年限的延長(zhǎng)，根際土壤細(xì)菌的豐富度和Shannon-Wiener多樣性均有所降低，而真菌的豐富度和多樣性有所升高，且成熟期>花果期。連作對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的Pielou均勻度指數(shù)影響不明顯，說明各處理土壤微生物類群分布比較均勻。連作明顯改變了土壤中土著細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，一些土著細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量減少或消失；土壤真菌的優(yōu)勢(shì)種群隨連作年限的變化較大，某些真菌類群大量富集，而另一些真菌數(shù)量明顯減少，甚至消失，其中，加工番茄連作5年時(shí)土壤中新出現(xiàn)的真菌優(yōu)勢(shì)種群最多，且與其他真菌種群的數(shù)量差異較大。加工番茄連作后土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)失衡可能是產(chǎn)生連作障礙問題的重要因素。從條帶測(cè)序結(jié)果看，各連作處理土樣中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacterramosu)、α-變形桿菌(Alphaproteobacterium)、不可培養(yǎng)的α-變形桿菌(UnculturedAlphaproteobacterium)和不可培養(yǎng)細(xì)菌(Uncultured bacterium)，真菌優(yōu)勢(shì)種群屬于不可培養(yǎng)真菌(Uncultured fungus)、Geosmithiaputterillii、 淀粉絲菌(Amylomycesrouxii)、熱帶念珠菌(Candidatropicalis)和漆斑菌屬(Myrotheciumsp)?？傊?，加工番茄連作導(dǎo)致根際有益菌數(shù)量減少而病原菌大量滋生，從而降低了加工番茄抵御病害的能力。

加工番茄；變性梯度凝膠電泳技術(shù)；根際土壤；微生物多樣性；連作

土壤微生物群落的組成及其多樣性是衡量土壤性質(zhì)和功能的一個(gè)重要指標(biāo)，可直接預(yù)警土壤健康受損情況或恢復(fù)潛力的靈敏度[1]。連作障礙的成因極其復(fù)雜,研究表明：土壤微生物數(shù)量和種群構(gòu)成發(fā)生變化是引起連作障礙問題的本質(zhì)原因，韓劍等[2]、劉軍等[3]研究棉花長(zhǎng)期連作障礙時(shí)發(fā)現(xiàn)，連作5 a后，土壤微生物的菌群結(jié)構(gòu)向真菌型過渡，拮抗菌減少，病原菌積累，土壤質(zhì)量劣化。已有研究表明，植物土傳病害的絕大多數(shù)是真菌病原體觸發(fā)，如棉花黃萎病是一種土傳真菌病害的典型[4]。作物長(zhǎng)期連作后會(huì)破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性平衡[5-6]。張重義等[7]研究地黃多年連續(xù)種植時(shí)發(fā)現(xiàn)，重茬地黃根際細(xì)菌的種類大量減少，是造成根際土壤微生物群落功能紊亂的因素。馬云華等[8]發(fā)現(xiàn)隨著黃瓜連作年限的增加,其根際土壤微生物的總量、細(xì)菌和放線菌數(shù)均呈倒“馬鞍” 型變化，真菌的數(shù)量呈線性增長(zhǎng), 微生物由細(xì)菌型向真菌型過渡, 其中氨化細(xì)菌和尖孢鐮刀菌分別為溫室黃瓜的連作土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌生理群。生產(chǎn)實(shí)踐也證明，連作障礙產(chǎn)生的根本原因是微生物種群減少和有害微生物的數(shù)量增加?？梢?，土壤微生物活性轉(zhuǎn)變是產(chǎn)生連作障礙的原因之一。因此，研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性和動(dòng)態(tài)性等信息，為深入揭示加工番茄連作障礙形成的分子機(jī)制和探索合理有效的消減策略提供一定的理論依據(jù)。迄今為止，有關(guān)加工番茄連作障礙機(jī)理的研究?jī)H限于自毒作用、酶活性、土壤微生物數(shù)量等方面。如李志宏[9]研究表明加工番茄根、莖、葉腐解物中的化感物質(zhì)對(duì)加工番茄幼苗的生長(zhǎng)、根系活力、根系 SOD及 CAT 活性均有抑制作用，并且隨著處理濃度的增加，其抑制作用也隨之增強(qiáng)；劉易等[10]發(fā)現(xiàn)加工番茄的根系殘?bào)w浸提液對(duì)土壤過氧化氫酶及磷酸酶活性均有激活作用,土壤脲酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低；孫艷艷等[11]認(rèn)為，連作后根際土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化, 反硫化細(xì)菌數(shù)量隨著連作年限的延長(zhǎng)而增加, 硝酸細(xì)菌以及好氧性自身固氮菌數(shù)量呈遞減的趨勢(shì)。劉慧杰等[12]的研究表明利用PCR-DGGE 技術(shù)能更客觀地反映紅樹林沉積物中真實(shí)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息。而關(guān)于加工番茄連作土壤根際微生物尤其是未培養(yǎng)微生物連續(xù)變化的研究報(bào)道較少。PCR-DGGE 技術(shù)以土壤微生物總的基因組 DNA 為研究對(duì)象，通過比較細(xì)菌種群 16S rDNA及真菌28S rDNA 核糖體間隔區(qū)的基因信息，有效消除了傳統(tǒng)培養(yǎng)中由于培養(yǎng)基的選擇性而導(dǎo)致微生物群體多樣性喪失等問題[13]。本試驗(yàn)運(yùn)用聚合酶鏈-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)研究了不同種植年限、不同生育階段加工番茄根際土壤微生物類群的豐度、區(qū)系結(jié)構(gòu)和代謝類群多樣性的差異及變化趨勢(shì)，分析和比較了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性和動(dòng)態(tài)性等信息，以期為深入揭示加工番茄連作障礙形成的分子機(jī)制和探索合理有效的消減策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在新疆石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站(東經(jīng)85°59′50″，北緯44°18′58″)的加工番茄長(zhǎng)期連作定點(diǎn)微區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行。海拔437～450 m，年日照時(shí)數(shù)為2 721～2 818 h，無霜期為168～171 d，≥10 ℃的活動(dòng)積溫為3 570～3 729 ℃，年均降水量208 mm，蒸發(fā)量1 660 mm。屬于典型的大陸性氣候，光照充足但干燥少雨，晝夜溫差大，適合灌溉農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。土壤類型為典型灌耕灰漠土(calcaric fluvisal)，土壤質(zhì)地為砂壤土。加工番茄4塊連作地土壤的基本理化性質(zhì)見表 1。

表1 加工番茄不同連作年限試驗(yàn)地耕層土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of tested soil of processing tomatoes under different years of continuous cropping

注：同列中數(shù)值后面的不同小寫字母表示不同連作處理間差異顯著(P<0.05)。
Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different continuous cropping years(P<0.05).

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2007年在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站選取休閑3 a以上的空地，南北走向，長(zhǎng)12 m，寬5 m，面積60 m2。將該空地劃分為3個(gè)小區(qū)，每區(qū)面積均20 m2，每個(gè)小區(qū)做3次重復(fù)。同時(shí)，開始種植加工番茄，番茄主栽品種‘里格爾87-5’，種植密度為4.8萬株·hm-2。采用機(jī)采模式，一膜兩行直播種植，寬窄行配置80 cm+40 cm，株距35 cm。7～8 d滴水1次，共計(jì)12次，生育期內(nèi)滴水6 250 m3·hm-2。隨水滴肥，生育期內(nèi)滴施純氮(N)207 kg·hm-2，磷(P2O5)84.86 kg·hm-2，鉀(K2O)56.18 kg·hm-2。其他管理同大田生產(chǎn)。自2007年10月到2014年10月加工番茄收獲，連續(xù)分別形成了種植1 a(CK)、連作1、2、3、4、5、6、7 a 7個(gè)加工番茄連作處理。取連作1 a(2014年)、連作3 a(2012年)、5 a(2010年)和7 a(2007年)4個(gè)加工番茄根際土壤，分析土壤微生物種群變化。

1.3 供試土壤采集及預(yù)處理

在加工番茄連作1 a、3 a、5 a、7 a小區(qū)于花果期(FS)和成熟期(MS)按5點(diǎn)取樣法分別選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的加工番茄植株15株，將其根系區(qū)土壤用鐵鏟挖出，抖掉根系外圍土，取緊貼在根表附近的土樣，將所得5 個(gè)土樣制成混合土樣，仔細(xì)剔除植物殘?bào)w、石頭和其他雜物，混勻后置于無菌袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm 土篩后保存于-80 ℃冰箱。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 土壤微生物基因組DNA的提取和純化 用 PowerSoil○RDNA Isolation kit(t50)試劑盒方法，準(zhǔn)確稱0.50 g土壤樣品，按試劑盒實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行土壤微生物的總DNA提取，于-20 ℃保存。

1.4.2 樣品DNA的PCR擴(kuò)增 選擇細(xì)菌通用引物 R518/F357-GC，真菌通用引物 NS1/Fung-GC對(duì)土壤微生物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物具體信息如表2所示。在進(jìn)行變性梯度凝膠電泳時(shí),在引物F357和Fung的5′端分別加GC夾來防止DNA片段過早解鏈。

細(xì)菌PCR擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性0.5 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，每個(gè)循環(huán)加1 s，共30個(gè)循環(huán)，再于72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。50 μL反應(yīng)體系：ddH2O 41.25 μL，10×Buffer(含2.0 mmol·L-1MgCl2)5 μL，dNTP(10 μmol·L-1)1 μL，F(xiàn)357-GC(10 mmol·L-1)1 μL，R518(10 mmol·L-1)1 μL，Taq酶(5 U· μL-1)0.25 μL，模板DNA 0.5 μL。PCR 產(chǎn)物檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物各3 μL，15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE緩沖液，120 V穩(wěn)壓電泳30 min，凝膠成像儀拍照,檢查擴(kuò)增效果。

真菌PCR擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。50 μL反應(yīng)體系： 10×Buffer(含2.0 mmol·L-1MgCl2)5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，F(xiàn)ung-GC(20 pmol·L-1)1 μL，NS1(20 pmol·L-1)1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.4 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O至總體積50 μL。PCR 產(chǎn)物檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物各2 μL，15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE緩沖液，120 V穩(wěn)壓電泳15 min，用凝膠成像儀拍照,檢查擴(kuò)增效果。

表2 PCR擴(kuò)增引物的序列Table 2 PCR amplification of sequences of the primers

注：* GC 夾：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC。
Note:*GC clamp:CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC.

1.4.3 PCR產(chǎn)物的DGGE分析 分別取細(xì)菌V3區(qū)和真菌28 S樣品各400 ng的PCR產(chǎn)物，選D-Code system(Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA，USA)對(duì)樣本進(jìn)行DGGE分析。具體條件為：(1)細(xì)菌：體積分?jǐn)?shù)為80%的聚丙烯酰胺凝膠[m(丙稀酰胺)∶m(雙丙稀酰胺)=37.5∶1]，體積分?jǐn)?shù)為30%～60%的變性劑，在60 V電壓，60 ℃恒溫，1×TAE 緩沖液中電泳16 h。電泳結(jié)束后，用ddH2O洗膠，然后將膠放進(jìn)含EB的染液中，置于搖床上染色30 min后，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖譜。(2)真菌：質(zhì)量濃度為80 g·L-1的聚丙烯酰胺凝膠[m(丙稀酰胺)∶m(雙丙稀酰胺)=37.5∶1]，體積分?jǐn)?shù)為15%～40%的變性劑，在70 V電壓，60 ℃恒溫，1×TAE 緩沖液中電泳13 h。電泳結(jié)束后，用ddH2O沖洗膠，然后將膠放進(jìn)含TE的染液中，同細(xì)菌。

1.4.4 DGGE圖譜優(yōu)勢(shì)條帶的回收和測(cè)序 分別選取經(jīng)過EB染色和TE染色照相后有代表性的聚丙烯酰胺凝膠，置于紫外燈下，用滅菌的手術(shù)刀片，將明亮清晰的目標(biāo)DGGE條帶小心完整地切下，裝入1.5 mL離心管中，按SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司，SK8131)方法回收，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述DGGE條帶切割后分別放入 EP 管中，用ddH2O多次沖洗，直到無染色劑殘留后完全浸于50 μL 去離子水碾碎，4 ℃放置過夜保存，以溶出膠條中的DNA片段。以DNA浸出液為模板，分別用相應(yīng)的細(xì)菌帶夾引物F357-GC/R518和真菌帶夾引物 NS1/Fung-GC按照前述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后，用DGGE對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行驗(yàn)證，判斷是否與所回收條帶的電泳行為相一致，待確定回收條帶的正確位置后，將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD○R18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，送上海生工生物工程股份有限公司純化測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工番茄連作土壤中微生物基因組 DNA 的提取及PCR擴(kuò)增

由圖1可見，加工番茄連作處理花果期和成熟期土壤樣品中所提取出的 DNA 片段大小相近且均約為 23 kb，條帶表現(xiàn)出較好的純度和完整性，可用于PCR 擴(kuò)增的模板用。進(jìn)一步觀察分析發(fā)現(xiàn)，加工番茄花果期和成熟期，不同連作年限處理下條帶亮度存在差異，可能是不同處理樣品中所含的微生物數(shù)量不同所致。

如圖2所示，用質(zhì)量濃度為15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)加工番茄不同生育時(shí)期不同連作年限處理下細(xì)菌16S rDNA和真菌28S rDNA擴(kuò)增條帶的亮度和純度都比較好，無非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。進(jìn)一步分析可知，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與目的片段相近，分別約為260 bp和400 bp?？梢姡琍CR的擴(kuò)增效果良好，可進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE 試驗(yàn)。

F.花果期 Means flowering fruit bearing stage；C.成熟期 Means maturity stage;0、3、5和7分別代表正茬(CK)、連作3 a、連作5 a和連作7 a The number 0, 3, 5 and 7 means first-planting,three years of continuous cropping, five years of continuous cropping and seven years of continuous cropping;MK.DL 2000 plus marker。下同 The same below
圖1 土壤微生物 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖譜
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of microbial DNA extracted from soil

圖2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products

2.2 不同連作年限的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

加工番茄花果期和成熟期不同連作年限中土壤細(xì)菌的16S rDNA PCR-DGGE圖譜如圖3所示。各處理對(duì)應(yīng)的泳道所呈現(xiàn)的條帶數(shù)和位置差異不明顯，但有個(gè)別條帶的亮度存在一定的差異。土壤中的優(yōu)勢(shì)種群可用DGGE圖譜中出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)條帶評(píng)價(jià)，即亮條帶反映土壤中某一時(shí)期菌群富集成為優(yōu)勢(shì)種，且亮條帶數(shù)表示種群的數(shù)量。A、C、F、G、H、I、K條帶均出現(xiàn)在所有連作泳道，但亮度不同，說明土壤中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群隨加工番茄生育時(shí)期和連作年限的變化而變化?；ü?，A、F、K條帶的亮度隨著連作年限的增加變化不大，但K條帶的亮度> F條帶> A條帶，說明其所代表的細(xì)菌種群受連作影響很小，K條帶代表的細(xì)菌群落一直處于富集狀態(tài)；成熟期，A和F條帶亮度有所增加，K條帶亮度變暗，但在不同連作處理下其亮度未發(fā)生明顯的變化，表明A條帶及F條帶所代表的細(xì)菌數(shù)量有所增加，而K條帶則相反。C和I條帶的亮度隨著連作年限的增加先明后暗，說明其所代表的細(xì)菌種群連作3 a時(shí)數(shù)量最多，成為優(yōu)勢(shì)種群，連作5 a后數(shù)量減少，它們的優(yōu)勢(shì)地位被其他種群取代；隨著連作年限的延長(zhǎng)，G和H條帶代表的細(xì)菌數(shù)量在花果期基本沒有發(fā)生變化，成熟期在一定程度上有所富集，且G條帶在連作3 a時(shí)代表優(yōu)勢(shì)種群，而H條帶在連作5 a時(shí)代表優(yōu)勢(shì)種群。個(gè)別連作泳道有其特有的條帶，如在加工番茄成熟期，連作7 a泳道的J和L條帶，連作5a的B、D和E條帶，均代表細(xì)菌種群在該時(shí)期是優(yōu)勢(shì)種群?？梢?，加工番茄連作改變了不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，一些土著細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量減少，甚至消失。

細(xì)菌基因組DNA的DGGE圖譜共有43個(gè)帶型，不同泳道的條帶數(shù)在13～28條間變化，差異較大(表3)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著加工番茄連作年限的增加，土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性逐漸下降，但成熟期的細(xì)菌多樣性大于花果期，這表明連作導(dǎo)致加工番茄土壤生長(zhǎng)環(huán)境趨于單一，造成細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)失衡。但從均勻度指數(shù)看，各處理樣品的均勻度指數(shù)相對(duì)比較穩(wěn)定，可能原因是加工番茄連作導(dǎo)致該群體中總體類群的改變, 但個(gè)體的豐富度變化不大。

圖3 土壤細(xì)菌 16S rDNA 的PCR-DGGE圖譜Fig.3 Denaturing gradient gel electrophoresis of bacteria 16S rDNA PCR amplification products

表3 加工番茄生育期不同連作年限根際土壤微生物群落多樣性Table 3 Diversity indices of microbial community in root zone soils of processing tomatoes in different continuous cropping years

2.3 不同連作年限的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

如圖4所示，與細(xì)菌DGGE圖譜不同，各處理土壤樣品中真菌基因組DNA的DGGE圖譜條帶明亮，背景清晰，各泳道間條帶數(shù)和位置存在較大差異，且每一個(gè)泳道都有明晰可辨的獨(dú)特條帶(如d、g、m、o等)，連作泳道間共有條帶的亮度也不同(如 b、c、e、k、l等)。條帶亮度的轉(zhuǎn)變意味著其所代表種群的真菌數(shù)量的變化。加工番茄連作導(dǎo)致a、b、c、k條帶的亮度變暗，甚至消失；e、f、h、j、l條帶的亮度為成熟期>花果期，其中以連作7 a 最亮，正茬(CK)最暗。個(gè)別泳道亮度明顯的條帶出現(xiàn)在特定的生育時(shí)期和連作年限。如花果期正茬處理的i條帶和連作3 a時(shí)的m條帶亮度最強(qiáng)；成熟期連作7 a處理的d、n條帶亮度也最強(qiáng)，說明其所代表的真菌數(shù)量最多，屬優(yōu)勢(shì)種群。隨著加工番茄生育進(jìn)程的延長(zhǎng)，g條帶代表的真菌數(shù)量在連作5 a時(shí)的花果期和連作7 a時(shí)的成熟期2次出現(xiàn)大量富集成為優(yōu)勢(shì)種群，而后消失；o條帶所代表的真菌群落3次成為優(yōu)勢(shì)種群，分別出現(xiàn)在正茬和連作7 a處理的花果期，連作3 a處理的成熟期；p條帶的亮度在所有泳道的變化不明顯且比較暗淡，其所代表的真菌數(shù)量最少。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，加工番茄花果期和成熟期，連作7 a處理的高亮度條帶數(shù)最多，與正茬(CK)相比，d、e、f、g、h、l和n等條帶的亮度明顯增強(qiáng)，而a、b、c等條帶的亮度明顯減弱?？梢姡庸し堰B作導(dǎo)致土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，某些真菌類群大量富集，其他真菌類群數(shù)量減少或消失，這可能是加工番茄在不同生育時(shí)期不同連作年限下根系分泌物的數(shù)量、種類等不同所致。

圖4 土壤真菌 28S rDNA 的 PCR-DGGE 圖譜Fig.4 Denaturing gradient gel electrophoresis of fungal 28S rDNA PCR amplification products

與土壤細(xì)菌相比， 加工番茄各連作處理土樣中共含有24條不同真菌基因組DNA的DGGE圖譜條帶，含有6～15種帶型，且差異明顯(表3，圖4)。成熟期連作7 a根際土壤樣品的條帶數(shù)最多，正茬土壤樣品的條帶數(shù)最少，僅為6條。連作3 a時(shí)，花果期和成熟期土樣中含有相同的條帶數(shù)。從多樣性指數(shù)看，土壤真菌的豐富度和多樣性均隨連作年限的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，這表明連作使土壤真菌的多樣性水平升高，土壤微生物從細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化。從均勻度指數(shù)分析，各處理土樣的均勻度指數(shù)無明顯差異，說明連作雖然明顯改變了土壤真菌的總體類群，但并沒有造成個(gè)體豐富度的明顯變化。

2.4 不同連作年限的土壤微生物聚類分析

如圖5所示，聚類分析結(jié)果表明：連作明顯改變了加工番茄根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成。其中，連作3 a和5 a處理距離最近，具有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，聚為一類，且成熟期的相似性(78%)大于花果期(69%)；連作7 a處理與其他處理的差異明顯，獨(dú)成一支，相似性最低(49%)。從加工番茄不同生育時(shí)期分析，正茬(CK)處理的花果期和成熟期的相似性高達(dá)67%，說明正茬(CK)土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成隨加工番茄生育時(shí)期的變化無明顯改變。花果期，當(dāng)相似性為58%時(shí)，不同連作處理可聚為3類，其中正茬(CK)和連作7 a處理分別單獨(dú)成為一支，連作3 a和5 a聚為一支；成熟期，當(dāng)相似性為60%時(shí)，正茬(CK)、連作3 a、5 a和7 a可聚為一類。由此可見，連作對(duì)加工番茄成熟期土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響小于花果期，說明成熟期時(shí)雖然土壤細(xì)菌數(shù)量有所減少，但其群落結(jié)構(gòu)組成相對(duì)穩(wěn)定。

圖5 土壤細(xì)菌 16S rDNA 的 UPGMA 聚類分析Fig.5 UPGMA cluster analysis of bacteria 16S rDNA PCR amplification products

加工番茄連作土壤中真菌 DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果如圖6所示。從加工番茄不同生育時(shí)期分析，當(dāng)相似性為60%時(shí)，可將各處理聚為2大類，其中，花果期各連作處理的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相似性達(dá)到64%，聚為一類；成熟期各連作處理可分成3小類：正茬(CK)和連作5 a處理相距最近，相似性為74%，聚為一類；連作3 a與其他處理的相似度性58%，獨(dú)成一支；連作7 a與其他處理的相似性最低(53%)，單成一類。這表明加工番茄成熟期根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)明顯改變，而花果期根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化相對(duì)較小。同一生育時(shí)期連作明顯改變土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)，連作7 a與其他處理的距離較遠(yuǎn)，相似性在64%以下，獨(dú)成一支；而連作5 a以內(nèi)的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)改變不顯著，相似性高達(dá)72%以上。

2.5 不同連作年限的土壤微生物優(yōu)勢(shì)種群分析

選擇圖3中土壤細(xì)菌的DGGE圖譜中較明亮可辨的條帶C、G、H、I和K進(jìn)一步擴(kuò)增、測(cè)序并獲取成功。由圖 3可知，加工番茄不同生育時(shí)期各連作處理土壤中均存在C、G、H、I條帶，但條帶的亮度存在一定的差異，說明它們分別代表一種加工番茄連作土壤中土著的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群。K條帶在加工番茄花果期存在于不同連作年限土壤中，而在成熟期沒有出現(xiàn)，說明它代表的是一種特有的存在于花果期土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群。將上述條帶的測(cè)序結(jié)果與NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術(shù)信息中心)查找比對(duì)發(fā)現(xiàn)，存在4條與測(cè)序序列相似性最高的序列，相似性高達(dá)96%～100%(表4)，大多屬于可培養(yǎng)細(xì)菌。加工番茄花果期C條帶序列和已發(fā)表的Pseudomonassp.系列的序列相似性高達(dá)100%；成熟期G、H和I條帶與已發(fā)現(xiàn)的未培養(yǎng)細(xì)菌種屬核酸序列非常相近，且相似性分別高達(dá)100%、96.3%和100%。

圖6 土壤真菌 28S rDNA 的 UPGMA 聚類分析Fig.6 UPGMA cluster analysis of fungal 28S rDNA PCR amplification products

表4 土壤細(xì)菌的DGGE回收條帶序列分析Table 4 Sequence analysis of bands excised from DGGE gel derived from soil bacteria

注：大寫字母C、G、H、I和K對(duì)應(yīng)圖3中相應(yīng)的條帶。
Note: The capital letter C, G, H, I and K correspond to the bands C, G, H, I and K in figure 3.

選取土壤真菌的DGGE 圖譜中明亮而清晰的條帶a、g、i、k、 l、 n 和 o等(圖4)進(jìn)行切膠回收，經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序成功。將上述條帶的測(cè)序結(jié)果與NCBI查找比對(duì)發(fā)現(xiàn)(表5)，a條帶存在于加工番茄不同生育時(shí)期各連作處理土壤中，且亮度變化不大，說明其所代表的是一種加工番茄連作土壤中土著的真菌優(yōu)勢(shì)種群；g條帶只出現(xiàn)于連作5 a的花果期和連作7 a處理的成熟期，且亮度清晰可辨，其與已發(fā)現(xiàn)的可培養(yǎng)Myrotheciumsp.序列的相似度為99%，可能同屬真菌；i條帶與不可培養(yǎng)真菌Uncultured fungus(JQ581576)序列的相似性為100%，說明它僅僅在正茬處理的花果期表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)種群。加工番茄成熟期k條帶的亮度以連作7 a處理最強(qiáng)，連作5 a次之，連作3 a時(shí)變暗或消失，而其與Geosmithiaputterillii序列的相似性達(dá)到97%，表明Geosmithiaputterillii種群數(shù)量受連作影響而不斷減少；l條帶同樣出現(xiàn)在所有土壤樣品中，其中連作7 a處理的花果期和成熟期亮度均最高，而其與Rhizopusoryzae序列之間存在99%的相似性，說明Rhizopusoryzae種群數(shù)量隨著連作年限的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)；條帶n是成熟期土壤特有的條帶，連作3 a時(shí)亮度較暗，而連作7 a后顯著變亮，且與Amylomycesrouxii序列有99%的相似性，意味著Amylomycesrouxii可能是土壤中真菌的優(yōu)勢(shì)種群；o條帶與Candidatropicalis序列的相似性為96%，只見于正茬(CK)處理的花果期和連作3 a 處理的成熟期，且后者亮度較高。可見，加工番茄連作后土壤的真菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

表5 土壤真菌的DGGE回收條帶序列分析Table 5 Sequence analysis of bands excised from DGGE gel derived from soil fungi

注：小寫字母a、g、i、k、l、n和o對(duì)應(yīng)圖4中相應(yīng)的條帶。
Note: The lowercase letter a, g, i, k, l, n and o correspond to the bands a, g, i, k, l, n and o in figure 4.

3 討 論

利用PCR-DGGE技術(shù)可以更加客觀準(zhǔn)確地揭示微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性變化，對(duì)研究土壤環(huán)境質(zhì)量變化情況具有重要的作用。從土壤微生物DNA基因組的DGGE圖譜可以看出，連作導(dǎo)致細(xì)菌類群共有條帶的亮度變暗，而真菌類群共有條帶亮度增強(qiáng)，說明細(xì)菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增加，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)趨于真菌化，這與前人得出的結(jié)論相一致[12]。作物連作障礙的成因與根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡緊密相關(guān)。多年來，前人受到實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制，多采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法研究連作對(duì)土壤微生物群落及結(jié)構(gòu)變化的影響，雖然在一定程度上有助于認(rèn)識(shí)和揭示連作障礙產(chǎn)生機(jī)理，但是該方法所得的研究結(jié)果存在較大的差異性，并不能客觀、有效、全面地反映土壤微生物群落變化的情況，原因是其受試驗(yàn)培養(yǎng)條件的影響較大，且土壤中可培養(yǎng)微生物的種類及數(shù)量相當(dāng)有限[14]。1993年P(guān)CR-DGGE 技術(shù)被Myers 等[15]首次應(yīng)用到微生物生態(tài)學(xué)以來，經(jīng)過多年不斷的發(fā)展與改進(jìn)，已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者研究自然界中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性、微生物種群動(dòng)態(tài)變化等的主要分子工具之一[16-18]。Buchan 等[19]利用T-RFLP 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)沼澤枯草腐敗過程中細(xì)菌和真菌的群落動(dòng)態(tài)演替及優(yōu)勢(shì)種群。馬寧寧等[20]發(fā)現(xiàn)設(shè)施番茄長(zhǎng)期連作并沒有明顯改變土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，卻顯著改變了土壤真菌的群落多樣性。張偉等[21]認(rèn)為長(zhǎng)期連作改變了新疆棉花土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，但連作5 a后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨于回升和穩(wěn)定。本研究通過對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，加工番茄連作減少了土壤中土著細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群的數(shù)量，而一些土著真菌種群數(shù)量有所增加，其他真菌種群數(shù)量有所減少，說明加工番茄根際土壤微生物區(qū)系有所變化，這與前人的研究結(jié)果相似[22]。

作物連作會(huì)降低土壤微生物多樣性，表現(xiàn)在土壤微生物群落的物種優(yōu)勢(shì)度、均勻度和豐富度的降低[22]。但也有不同研究結(jié)論，如馬寧寧等[20]發(fā)現(xiàn)連作在一定程度上提高土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)，而真菌多樣性指數(shù)呈先升后降，連作 20 a最高；張偉等[21]認(rèn)為連作10 a以內(nèi)，使得土壤細(xì)菌群落的多樣性和均勻度指數(shù)逐漸增大，而豐富度指數(shù)不斷下降，當(dāng)連作年限超過 10 a后，土壤細(xì)菌群落各指數(shù)有所恢復(fù)或形成一種新的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。本研究表明，因加工番茄生育時(shí)期的變化，連作對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性的影響差異較大，其中連作導(dǎo)致土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性有所降低，且成熟期>花果期，而土壤真菌群落的豐富度和多樣性有所升高，且花果期<成熟期。從均勻度指數(shù)看，根際土壤細(xì)菌和真菌群落的分布都比較穩(wěn)定，受加工番茄生育時(shí)期和連作年限的影響不明顯?？梢?，PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用在研究連作對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響時(shí)，所得結(jié)構(gòu)差異較大，一方面，這與所選擇的真菌和細(xì)菌DNA擴(kuò)增區(qū)域、PCR擴(kuò)增條件、引物序列及大小等不同有關(guān)；另一方面，土壤類型、作物品種、氣候條件、田間管理和施肥等均會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生重要的影響。

土壤中細(xì)菌數(shù)量最大，有利于其群落結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境變化的能力。土壤真菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于細(xì)菌，且對(duì)土壤環(huán)境的變化極其敏感。有研究認(rèn)為，土壤類型對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響較大，而土壤管理措施對(duì)真菌群落的影響較大，原因在于土著細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不如土著真菌群落，盡管細(xì)菌數(shù)量比真菌數(shù)量大的多，但是土著真菌的優(yōu)勢(shì)種群在受到人為耕作措施、土壤溫度及濕度等的影響時(shí)并沒有消失[23]。本研究表明，加工番茄連作在一定程度上降低了土壤細(xì)菌的多樣性和豐富度指數(shù)，同時(shí)提高了土壤真菌的多樣性和豐富度指數(shù)，但土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性低，種群數(shù)量差異較大，和優(yōu)勢(shì)種群的種類和數(shù)量也存在差異；相反，連作顯著降低了土壤中某些土著真菌的數(shù)量如子囊菌屬(Pulchromycesfimicola)和稻根霉菌(Rhizopusoryzae)，同時(shí)也顯著提高了某些真菌數(shù)量如未可培養(yǎng)真菌(Uncultured fungus)、漆斑菌屬(Myrotheciumsp.)、毛霉菌(Amylomycesrouxii)和熱帶念珠菌(Candidatropicalis)，這說明土壤真菌對(duì)連作的反應(yīng)更敏感。

作物連作會(huì)造成土壤中某些微生物種群富集，而某些微生物種群數(shù)量降低的結(jié)果說明土壤微生物具有選擇適應(yīng)性[24]。吳林坤等[25]利用T-RFLP技術(shù)研究地黃多年栽植時(shí)發(fā)現(xiàn)，地黃頭茬土壤菌群以厚壁菌門(PhylumFirmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，且富含假單胞菌、芽孢桿菌等有益生防菌，而地黃重茬根際土壤中Flexibacterpolymorphus、Clostridiumghoni以及Clostridiumsp.等病原菌大量滋生。本研究中，土壤細(xì)菌的DGGE圖譜中C和I條帶分別說明假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和α-變形菌(Alphaproteobacteria)是加工番茄土壤中土著的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群，前者是一種重要的PGPR菌株(植物根際促生菌)，具有較好的生物防治土傳病害發(fā)生的效果[26-28]。同時(shí)，土壤真菌DGGE圖譜中各處理均含有亮度較高且獨(dú)立的條帶如i、g、n和o等，說明不同連作年限及不同生育時(shí)期的土壤樣品中均存在升高的和降低的真菌種群，其中，g條帶所代表的漆斑菌屬(Myrotheciumsp.)以及n條帶所代表的毛霉菌(Amylomycesrouxii)在加工番茄正茬處理的成熟期為優(yōu)勢(shì)種群，而條帶o代表的熱帶念珠菌(Candidatropicalis)在連作7 a的花果期和連作5 a的成熟期大量富集，成為新的優(yōu)勢(shì)群落。其中，漆斑菌屬(MyrotheciumTode ex Link)的病原真菌可引起加工番茄植株葉部病害，尤其露濕漆斑菌(M.roridumTode ex Fr.)是一種侵染力強(qiáng)、發(fā)病快、傳播迅速的真菌病害，可在加工番茄采摘后引發(fā)果實(shí)的腐爛病。但關(guān)于這些微生物在土壤中的作用尚未見報(bào)道，今后還需進(jìn)一步研究?？梢?，加工番茄連作改變了土壤真菌的優(yōu)勢(shì)種群平衡，可能在一定程度上引發(fā)連作障礙。

目前，國內(nèi)采用PCR-DGGE法側(cè)重于研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，而有關(guān)土壤真菌的相關(guān)研究比較缺乏。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用NS1/Fung-GC作為土壤真菌的引物，能夠得到條帶明亮清晰、可分辨條帶數(shù)量較多、背景明確的電泳圖譜，有利于研究不同連作處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化情況。前人研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)時(shí)多針對(duì)16S rDNA V3區(qū)而設(shè)計(jì)引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于目的片段較短，一些大小相近的細(xì)菌不能被有效地區(qū)分識(shí)別，使得在確定細(xì)菌的分類時(shí)準(zhǔn)確性不高，誤差較大[29]。本研究中，在滿足 DGGE 試驗(yàn)條件的前提下，直接以細(xì)菌16S rDNA 的V3～V4 可變區(qū)為目的序列，增大PCR 擴(kuò)增的目的片段，可以有效地區(qū)分親緣關(guān)系相近的細(xì)菌群落。然而，擴(kuò)增片段的增大也存在一些不利的因素，如電泳圖譜背景模糊、條帶不清晰、可分辨條帶數(shù)減少、因條帶增多而分離不完全等，這些問題需要通過調(diào)節(jié)電泳電壓、電泳時(shí)間、染色時(shí)間及變性劑濃度梯度選擇等試驗(yàn)條件來解決。

4 結(jié) 論

4.1 隨著加工番茄連作年限的延長(zhǎng)，根際土壤細(xì)菌的豐富度和Shannon-Wiener多樣性均有所降低，且成熟期>花果期；根際土壤真菌的豐富度和多樣性有所升高，且成熟期>花果期。連作對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的Pielou均勻度指數(shù)影響不明顯，說明各處理土壤微生物類群分布比較均勻。

4.2 連作明顯改變了土壤中土著細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，一些土著細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量減少或消失。土壤真菌的優(yōu)勢(shì)種群隨連作年限的變化較大，某些真菌類群大量富集，而另一些真菌數(shù)量明顯減少，甚至消失，其中，加工番茄連作5 a時(shí)土壤中新出現(xiàn)的真菌優(yōu)勢(shì)種群最多，且與其他真菌種群的數(shù)量差異較大。這種加工番茄連作后土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)失衡的現(xiàn)象可能是產(chǎn)生連作障礙問題的重要因素。

4.3 從條帶測(cè)序結(jié)果看，各連作處理土樣中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群屬于Pseudomonassp.、Arthrobacterramosus、Alphaproteobacterium、Unculturedalphaproteobacterium和Uncultured bacterium，真菌優(yōu)勢(shì)種群屬于Uncultured fungus、Geosmithiaputterillii、Amylomycesrouxii、Candidatropicalis和Myrotheciumsp.。

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(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Influence of Continuous Cropping of Processing Tomato on Diversity of Microflora in the Rhizosphere Soil.

SUN Wenqing,KANG Yalong,LIU Jianguo and JIANG Guiying.

(Key Laboratory of Oasis Ecology in Agriculture of Xinjiang Construction Groups, College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003, China)

The objective of this experiment was to determine the effect of continuous cropping on microbial diversity in the rhizosphere of processing tomato. The field experiment, which began in 2007, was conducted at the agriculture college experiment station of Shihezi university.Processing tomato(cv.Ligeer 87-5) had been continuously cropped at the site for 1 a, 3 a, 5 a, and 7 a. Soil samples were collected during the first flowering and fruit stage and the mature stage. The microbial structure and community diversity in the rhizosphere soil was analyzed using PCR-DGGE methods. The results showed that the Shannon-Wiener index and the richness index of fungi in rhizosphere soil decreased as the duration of continuous cropping increased. In contrast, the Shannon-Wiener index and the richness index of bacteria both increased. Both indexes were greater during the mature stage than during the first flowering and fruit stage. Pielou’s index was not sensitive to the duration of continuous cropping. This indicated that the evenness of the soil microbial communities was not affected by cropping duration. Soil bacterial community structure was significantly influenced by the duration of continuous cropping. Continuous cropping caused the populations of some dominant bacterial species to decrease and even disappear. The number of dominant fungal species varied significantly depending on the duration of continuous cropping. Continuous cropping significantly increased the total fungal population; however some fungal species decreased in population or disappeared. The populations of the dominant fungal species were generally greatest in plots that had been continuously cropped to tomato for 5 a. The populations of the dominant fungal species were significantly different than those of the non-dominant fungal species. The change in the population balance between bacteria and fungi may be one important reason for reduced yields in continuously cropped fields. Sequencing analysis of prominent electrophoretic bands showed that the dominant bacteria in the rhizosphere soil werePseudomonassp.,Arthrobacterramosus,Alphaproteobacterium,UnculturedAlphaproteobacterium, and Uncultured bacterium. The dominant fungi belonged to Uncultured fungus,Geosmithiaputterillii,Amylomycesrouxii,Candidatropicalis, andMyrotheciumsp. In summary, continuous cropping of processing tomato will lead to a reduction of beneficial bacteria and an increase of pathogenic bacteria in the rhizosphere soil, which decreases the disease resistance of disease processing tomato.

Processing tomato; PCR-DGGE; Rhizosphere soil; Microbial diversity; Continuous cropping

2016-04-19 Returned 2016-06-10

National Natural Science Foundation of China(No.31260142).

SUN Wenqing, male, master. Research area:physiological-ecological characteristic.E-mail:1162656579@qq.com

JIANG Guiying,female, professor. Research area:farmland ecological environment and crop physiology. E-mail:jgy67@126.com

日期：2017-06-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1109.040.html

2016-04-19

2016-06-10

國家自然科學(xué)基金(31260142)。

孫文慶，男，碩士，研究方向?yàn)樽魑锷砩鷳B(tài)。E-mail: 1162656579@qq.com 通信作者：蔣桂英，女，教授，主要從事農(nóng)田生態(tài)環(huán)境與作物生理研究。E-mail:jgy67@126.com

S154.3

A

1004-1389(2017)07-1099-12