王曉丹，肖 鋼，張振乾，官春云，陳社員，鄔賢夢，張?jiān)娺h(yuǎn)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

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光合作用合成相關(guān)差異蛋白對應(yīng)基因在高油酸油菜近等基因系中表達(dá)規(guī)律研究

王曉丹，肖 鋼，張振乾*，官春云，陳社員，鄔賢夢，張?jiān)娺h(yuǎn)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

【目的】本文探索了光合作用相關(guān)基因表達(dá)與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，加速高油酸油菜育種進(jìn)程。【方法】以高油酸油菜近等基因系出苗后7 d、5～6葉期和越冬期的葉片、花瓣和授粉后20～35 d的種子及角果皮為材料，利用定量PCR方法研究9個(gè)iTRAQ分析得到的差異蛋白對應(yīng)基因在不同生育期表達(dá)規(guī)律。【結(jié)果】在出苗后7 d、花期和授粉后20～35 d，高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜；5～6葉期、越冬期高油酸油菜的光合作用能力高于低油酸油菜。gi|515616基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料及低油酸油菜5～6葉期、越冬期葉片和授粉后20～35 d角果皮中不表達(dá)，在花、授粉后20～35 d種子中均不表達(dá)。gi|297853098, gi|297825149和gi|312282567基因及gi|50313237和gi|79475768基因分別具有相同的表達(dá)規(guī)律。gi|297825149基因在高油酸油菜角果皮中是唯一上調(diào)表達(dá)基因。gi|312282897基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料為唯一上調(diào)表達(dá)基因?！窘Y(jié)論】這些基因可作為高油酸油菜育種材料篩選的參考基因，加快育種進(jìn)程。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；光合作用；高油酸油菜

【研究意義】蛋白質(zhì)組學(xué)是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，被認(rèn)為是在基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后，生物系統(tǒng)研究的下一步[1-2]。然而，蛋白質(zhì)組的研究遠(yuǎn)比基因組學(xué)復(fù)雜，蛋白質(zhì)有很高的細(xì)胞特異性，即使是同一細(xì)胞的不同時(shí)期或在不同的環(huán)境下，它表達(dá)的蛋白質(zhì)也不盡相同[3]；同時(shí)，機(jī)體所處的不同環(huán)境和本身的生理狀態(tài)差異，會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有不同的剪切和轉(zhuǎn)譯成不同的蛋白，一個(gè)基因可能會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)，甚至幾十個(gè)蛋白質(zhì)[4]。iTRAQ技術(shù)是2004年新開發(fā)的同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)[5]，可以對樣本中的幾乎所有蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，從而獲得更為詳盡的樣品信息[6]，重復(fù)性和穩(wěn)定性高[7]。該技術(shù)在油菜分子生物學(xué)研究中也有不少應(yīng)用[8-9]，本實(shí)驗(yàn)室利用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組技術(shù)對高油酸油菜授粉后20～35 d種子進(jìn)行分析[10]，得到與光合作用相關(guān)的差異蛋白?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】不同生育期及不同器官的基因表達(dá)情況對于作物性狀育種研究有十分重要的意義，Abdelghani N等[11]采用定量PCR方法研究了與脂肪酸合成相關(guān)的基因在高油酸低亞麻酸埃塞俄比亞芥中的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)基因在種子外的器官中的表達(dá)情況在育種研究中也很有應(yīng)用價(jià)值。Noelle A等[12]通過利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測高油酸花生及其野生型種子和葉片中FAD2基因表達(dá)量快速檢測高油酸花生基因型。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室對轉(zhuǎn)錄組分析得到的光合作用相關(guān)差異基因在不同生育期及不同器官中的表達(dá)情況研究發(fā)現(xiàn)，一些基因的表達(dá)有規(guī)律，可用于高油酸油菜育種材料早期篩選研究[13]。光合作用是生物界賴以存在的基礎(chǔ)，也是農(nóng)作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)[14]，作物中90 %以上的干物質(zhì)直接來源于光合作用[15]，光合作用能力強(qiáng)有助于積累更多的干物質(zhì)，獲得更高的產(chǎn)量[16]。呂亞等[17]以木薯栽培種ZM-QZ1 為材料，采用雙向電泳方法，研究一天中不同時(shí)間點(diǎn)葉片光合作用差異蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與光合作用相關(guān)的關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平與凈光合速率在5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢一致，表明這些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與光合作用強(qiáng)度密切相關(guān)。Silke H等[18]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了光合作用相關(guān)基因在玉米葉片中表達(dá)情況。因此，研究光合作用相關(guān)的差異蛋白對應(yīng)基因的表達(dá)規(guī)律對于了解基因與光合作用之間的關(guān)系、作物產(chǎn)量等方面研究有十分重要的意義。【本研究切入點(diǎn)】在本研究中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對與光合作用相關(guān)的差異蛋白對應(yīng)基因在不同生育期的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期從中發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系及不同油酸含量油菜的光合作用能力差異，為高油酸油菜育種提高參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高油酸油菜近等基因系材料由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料所提供。本試驗(yàn)研究的基因?yàn)楦哂退嵊筒私然蛳挡牧鲜诜酆?0～35 d種子iTRAQ分析得到光合作用相關(guān)差異蛋白(差異在1.5倍以上)對應(yīng)基因。低油酸油菜(油酸含量56.2 %)為對照組，高油酸油菜(油酸含量81.4 %)為處理組。

儀器設(shè)備：Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific)，CFX96 CFX384熒光定量PCR(Bio-Rad)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 在出苗后7 d去根幼苗，5～6葉期(2015年12月10日)和越冬期(2016年1月5日)頂部葉片，盛花期(2016年3月18日)的花(自交套袋)，在授粉后20～35 d(2015年4月17日)未成熟種子及角果皮，以上材料各取10株，混合保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取 采用TransZol Up Plus RNA Kit(Trans Gene Biotech)提取總RNA，操作方法參照說明書。經(jīng)Nanodrop 2000檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA合格，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 定量PCR研究 逆轉(zhuǎn)錄、引物合成及定量PCR研究參照文獻(xiàn)[13]。試驗(yàn)進(jìn)行3次，取平均值。需要進(jìn)行研究的基因及其引物情況如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 出苗后7 d去根材料中基因表達(dá)情況

由圖1可知，gi|515616基因在高油酸油菜中不表達(dá)，gi|312282897基因在高油酸油菜中上調(diào)表達(dá)(3.544倍)，其余基因在高油酸油菜中下調(diào)表達(dá)，其中g(shù)i|297853098基因(15.743倍)、gi|6006279基因(13.0倍)差別較大，其次是gi|42571703基因(5.367倍)和gi|297825149基因(3.326倍)。在出苗后7 d，7個(gè)基因在高油酸油菜材料中下調(diào)表達(dá)，表明此時(shí)期高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜。

2.2 5～6葉期葉片中基因表達(dá)情況

從圖2可看出，gi|515616在低油酸油菜葉片中不表達(dá)，gi|297853098(2.837倍)，gi|312282897(3.950倍)在高油酸油菜葉片中下調(diào)表達(dá)，其余基因在高油酸油菜葉片中上調(diào)表達(dá)，其中g(shù)i|42571703(35.438倍)差別較大，其次是gi|297825149(4.754倍)和gi|79475768(3.377倍)。6個(gè)基因在高油酸油菜葉片中上調(diào)表達(dá)，表明在此時(shí)期高油酸油菜的光合作用能力強(qiáng)于低油酸油菜。

表1 與光合作用相關(guān)蛋白對應(yīng)基因及其引物

圖1 與光合作用相關(guān)差異蛋白對應(yīng)基因在出苗后7 d材料中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 7-day seedlings

圖2 與光合作用相關(guān)差異蛋白對應(yīng)基因在5～6葉期不同材料葉片中表達(dá)Fig.2 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 5-6 leaf stage leaves

2.3 越冬期葉片中基因表達(dá)情況

由圖3所示，gi|515616在低油酸油菜葉片中不表達(dá)，gi|79475768(3.607倍)、gi|312282567(3.198倍)和gi|50313237(1.245倍)在高油酸油菜葉片中下調(diào)表達(dá)，其余的基因在高油酸油菜中上調(diào)表達(dá)，其中g(shù)i|42571703(36.350倍)、gi|312282897(27.511倍)、gi|6006279(10.375倍)和gi|297853098(3.198倍)差別較大。5個(gè)基因在高油酸油菜葉片中上調(diào)表達(dá)，表明在此時(shí)期高油酸油菜的光合作用能力強(qiáng)于低油酸油菜。

2.4 花中基因表達(dá)情況

如圖4所示，gi|42571703(84.0倍)，gi|312282897(8.081倍)在高油酸油菜花中上調(diào)表達(dá)，gi|515616在2種油菜花中均不表達(dá)，其余的基因在高油酸油菜花中下調(diào)表達(dá)，其中g(shù)i|297853098(25.714倍)和gi|312282567(14.944倍)差別較大， 其次是gi|79475768(5.239倍)、gi|50313237(3.949倍)和gi|297825149(2.309倍)。6個(gè)基因在高油酸油菜花中下調(diào)表達(dá)，表明在花中高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜，也可能與采用的材料有關(guān)，光合作用主要發(fā)生在葉片中。

圖3 與光合作用相關(guān)差異蛋白對應(yīng)基因在不同材料越冬期葉片中表達(dá)Fig.3 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in overwintering period leaves

圖4 與光合作用相關(guān)差異蛋白對應(yīng)基因在不同材料花中的表達(dá)Fig.4 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in flowers

2.5 授粉后20～35 d種子中基因表達(dá)情況

如圖5所示，gi|515616在高油酸油菜授粉后20～35 d種子中不表達(dá)，gi|42571703(261.333倍)、gi|312282897(78.40倍)、gi|6006279(30.745倍)和gi|297825149(6.426倍)在高油酸油菜授粉后20～35 d種子中下調(diào)表達(dá)，gi|312282567(6.144倍)、gi|79475768(2.953倍)、gi|297853098(2.716倍)和gi|50313237(1.807倍)在高油酸油菜授粉后20～35 d種子中上調(diào)表達(dá)。

2.6 授粉后20～35 d角果皮中基因表達(dá)

從圖6可看出，gi|515616在低油酸油菜角果皮中不表達(dá)，gi|297825149(1.150倍)在高油酸油菜角果皮中上調(diào)表達(dá)，其余基因在高油酸油菜角果皮中下調(diào)表達(dá)，其中僅gi|6006279(3.13倍)和gi|312282567(2.4倍)差別在2倍以上。7個(gè)基因在高油酸油菜角果皮中下調(diào)表達(dá)，表明在此時(shí)期高油酸油菜的光合能力低于低油酸油菜，成熟期產(chǎn)量形成的重要時(shí)期，光合作用能力低可能是導(dǎo)致高油酸油菜與普通油菜產(chǎn)量存在一定差異的原因。

圖5 與光合作用相關(guān)差異蛋白對應(yīng)基因在授粉后20～35 d種子中的表達(dá)Fig.5 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 20-35 day seeds after pollination

圖6 與光合作用相關(guān)差異蛋白對應(yīng)基因在授粉后20～35 d角果皮中的表達(dá)Fig.6 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 20-35 day pod skin after pollination

3 討 論

由于基因表達(dá)的條件和表達(dá)的程度則隨時(shí)間、地點(diǎn)和環(huán)境條件而不同, 因而一個(gè)基因可以表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)目可能遠(yuǎn)大于一[4]。在本研究中，gi|312282897和gi|312282567為蕪菁甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因，表達(dá)的蛋白質(zhì)有2個(gè)；而甘藍(lán)型油菜正捕光色素蛋白復(fù)合物II類型III葉綠素a-b結(jié)合蛋白在授粉后20～35 d的種子中存在，而gi|515616基因在授粉后20～35 d的種子中不表達(dá)，可能是由于其它基因的表達(dá)產(chǎn)物隨時(shí)間、地點(diǎn)和環(huán)境條件發(fā)生改變或經(jīng)過翻譯后修飾和剪接，產(chǎn)生改變形成該蛋白質(zhì)，與甘藍(lán)型油菜正捕光色素蛋白復(fù)合物II類型III葉綠素a-b結(jié)合蛋白對應(yīng)基因并非是導(dǎo)致該蛋白質(zhì)表達(dá)的基因，因而在該時(shí)期種子中沒有表達(dá)。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)gi|515616基因在不同生育期的表達(dá)情況不同，可以此作為某個(gè)時(shí)期油菜高油酸材料篩選的指示基因，根據(jù)其是否表達(dá)來初步判斷該材料是否為需要的高油酸材料。同時(shí)，gi|297825149基因(高油酸油菜角果皮中是唯一上調(diào)表達(dá)基因)和gi|312282897基因(高油酸油菜出苗后7 d去根材料中為唯一上調(diào)表達(dá)基因)也可作為某個(gè)時(shí)期選擇育種材料的基因；另外，gi|312282567基因、gi|50313237基因和gi|79475768基因及gi|297853098基因和gi|297825149基因有相同的表達(dá)規(guī)律，這些基因的表達(dá)規(guī)律均可用于高油酸油菜育種材料早期篩選研究，減少大量繁瑣的田間工作，加快育種進(jìn)程。

Guan等[19]采用基因芯片技術(shù)對甘藍(lán)型油菜高油酸(71.71 %)和低油酸(55.6 %)材料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶為重要差異表達(dá)基因，且在高油酸材料中上調(diào)表達(dá)。這與本研究發(fā)現(xiàn)的該蛋白對應(yīng)基因gi|79475768在授粉后20～35 d表達(dá)情況一致。丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸, 控制著丙酮酸的外流量。因此，丙酮酸激酶的基因上調(diào), 將影響整個(gè)脂肪酸代謝過程[19]。

4 結(jié) 論

利用高油酸油菜近等基因系材料，對iTRAQ分析得到的9個(gè)與光合作用相關(guān)差異蛋白對應(yīng)基因在不同生育期表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究。

(1)gi|515616基因在不同生育期表達(dá)情況不同，在高油酸油菜出苗后7 d去根材料中不表達(dá)，低油酸油菜5～6葉期、越冬期葉片和授粉后20～35 d角果皮中不表達(dá)，在花中、授粉后20～35 d種子中均不表達(dá)。gi|312282897基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、越冬期葉片和花中上調(diào)表達(dá)，其中在高油酸油菜出苗后7 d去根材料為唯一上調(diào)表達(dá)基因，在高油酸油菜5～6葉期葉片、授粉后20～35 d種子和角果皮中下調(diào)表達(dá)。gi|297853098基因和gi|297825149基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、5～6葉期葉片、花和授粉后20～35 d角果皮中下調(diào)表達(dá)，越冬期葉片和授粉后20～35 d種子中上調(diào)表達(dá)，其中g(shù)i|297825149基因在高油酸油菜角果皮中是唯一上調(diào)表達(dá)基因。gi|6006279基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、花、授粉后20～35 d種子和角果皮中下調(diào)表達(dá)，5～6葉期和越冬期葉片中上調(diào)表達(dá)。gi|42571703基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、授粉后20～35 d種子和角果皮中下調(diào)表達(dá)，5～6葉期和越冬期葉片及花中上調(diào)表達(dá)。gi|312282567基因、gi|50313237基因和gi|79475768基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、越冬期葉片、花和授粉后20～35 d角果皮中下調(diào)表達(dá)，5～6葉期葉片和授粉后20～35 d種子中上調(diào)表達(dá)。

(2)在出苗后7 d材料中，有7個(gè)基因在高油酸油菜中下調(diào)表達(dá)；在花中，有6個(gè)基因在高油酸油菜花中下調(diào)表達(dá)；授粉后20～35 d角果皮中，有7個(gè)基因在高油酸油菜材料中下調(diào)表達(dá)；表明在出苗后7 d、花期和授粉后20～35 d高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜。5～6葉期葉片中，6個(gè)基因在高油酸油菜中上調(diào)表達(dá)；越冬期葉片中5個(gè)基因在高油酸油菜中上調(diào)表達(dá)；表明在5～6葉期、越冬期高油酸油菜的光合作用能力高于低油酸油菜。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Expression Patterns of Genes according to Photosynthesis-relatedDifferential Proteins in High Oleic Acid Rapeseed Isogenic Lines

WANG Xiao-dan, XIAO Gang, ZHANG Zhen-qian*, GUAN Chun-yun, CHEN She-yuan, WU Xian-meng, ZHANG Shi-yuan

(College of Agriculture, Hunan Agricultural University/Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Hunan Changsha 410128, China)

【Objective】In this paper, the relationship between gene expression and protein expression in photosynthesis were discovered so that the process of high oleic acid rape breeding could be accelerated. 【Method】The 7 days after emergence, 5-6 leaf stage, leaves of wintering period, petals, seeds and pods skins 20-35 days after pollination of high oleic acid rapeseed isogenic lines were used as tested materials to find out the expression rules in different development periods. The nine corresponding genes of the differential proteins which derived from the iTRAQ analysis were studied by Real-time quantitative PCR.【Result】In the development of 7 days after emergence, flowering and pollination 20-35 days, high oleic acid rapeseed had lower photosynthesis ability than low oleic acid rapeseed, while in the stages of 5-6 leaf and over-wintering, high oleic acid rapeseed had higher photosynthesis ability than low oleic acid rapeseed. Gi|515616 gene did not exist in high oleic acid rape of 7 days after emergence, the leaves of 5-6 leaf stage and over-wintering stage, pod skins 20-35 days after pollination of low oleic acid rapeseed, flower and seed 20-35 days after pollination of the two lines. The genes of gi|297853098, gi|297825149 and gi|312282567 had the same expression rules, while gi|50313237 and gi|79475768 had the same expression rules too. Gi|297825149 and gi|312282897 were the only up-regulated gene in pods skins and 7 days after emergence of high oleic acid rapeseed respectively.【Conclusion】These genes could be used as reference genes to screen high oleic acid rapeseed breeding materials, which would be useful to speed up the breeding process.

Real-time quantitative PCR；Photosynthesis；High oleic acid rapeseed

1001-4829(2017)7-1483-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.003

2016-07-23

國家自然科學(xué)基金“基于蛋白組學(xué)的油菜高油酸關(guān)鍵基因鑒定研究”(31201240)；國家973計(jì)劃“主要環(huán)境因子及生育期影響油菜油脂積累的分子基礎(chǔ)”(2015CB150206)；國家科技支撐計(jì)劃“油菜商業(yè)化育種研究與模式示范”(2014BAD01B07)；湖南省科技重大專項(xiàng)“高油酸油菜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(2014FJ1006)；作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開放課題“與脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)量研究及其功能驗(yàn)證”；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)開放基金“高油酸油菜近等基因系差異基因研究”(ZWKF201302)

王曉丹(1992-)，女，河南鄭州人，在讀研究生，從事油菜育種研究，Tel：13838378556，E-mail：13838378556@139.com；*為通訊作者：張振乾(1977-)，男，河南南陽人，副教授，博士，從事油菜育種研究，Tel：15974175419，E-mail：zzq770204@163.com。

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