黃好武，黃歡文，姜一平，管丫仔，馮家誠

（1.廣東省珠海市人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬＜珠海＞醫(yī)院，廣東 珠海 519100）

·實驗研究·

芹菜素對肺癌細胞的抗增殖作用和抗腫瘤藥物的增敏作用

黃好武1，黃歡文2，姜一平1，管丫仔1，馮家誠1

（1.廣東省珠海市人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬＜珠海＞醫(yī)院，廣東 珠海 519100）

目的 探討芹菜素對肺癌細胞的抗增殖作用和抗腫瘤藥物的增敏作用。方法 選擇鼠齡約5周A／J系小鼠140只，隨機分成3組，第1組40只，第2組60只，第3組40只，每組均平分成試驗組及對照組。鼠齡6～7周時，在第1組中試驗組、第2組經(jīng)腹腔注射4－（甲基亞硝胺基）－1－（3－吡啶）－1－丁酮（NKK）10mg／kg，第1組中對照組腹腔注射生理鹽水；第2～3 d，第2組中試驗組每日大劑量芹菜素灌胃；第3組給予NKK腹腔注射，給藥第52～62周，試驗組每日芹菜素大劑量灌胃；第2組中對照組、第3組中對照組小鼠分別以植物油大劑量灌胃。在試驗第52周將第1組、第2組小鼠處死，63周第5 d將第3組小鼠處死；3組小鼠均被處死解剖切片觀察，并利用奧沙利鉑及博來霉素對肺癌切片進行處理。結(jié)果 第1組中試驗組平均發(fā)現(xiàn)（1.35±0.22）個肺癌病灶，對照組未見癌性病灶；第2組中試驗組僅2只小鼠偶見肺癌病灶，對照組發(fā)現(xiàn)（1.71±1.28）個癌性病灶；第3組中試驗組發(fā)現(xiàn)（1.01±1.19）個癌性病灶，對照組發(fā)現(xiàn)（1.56±0.78）個癌性病灶。抑制率第1組為0，第2組為（94.32±0.27）%，第3組為（0.36±0.03）%；芹菜素與奧沙利鉑及博來霉素聯(lián)用存在一定的協(xié)同作用（CI多小于1）。結(jié)論 芹菜素對肺癌細胞的抗增殖作用和抗腫瘤藥物的增敏作用良好。

芹菜素；肺癌細胞；抗增殖；抗腫瘤；增敏作用

目前，肺癌主要采用化學(xué)治療（簡稱化療），但不良反應(yīng)多，程度輕重不等[1－3]。芹菜素為黃酮類物質(zhì)，存在于很多蔬菜水果中，但以芹菜根中含量（75 mg／kg）最高。芹菜素能抑制結(jié)腸癌、軟骨肉瘤等多種腫瘤細胞的生長、侵襲，促使腫瘤細胞凋亡，并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、眼部以及其他器官具有一定的防護作用[4－5]。芹菜素不僅自身具有一定的抗腫瘤作用，且與抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用，可能產(chǎn)生一定的協(xié)同作用[6]。本研究中選擇了140只5周齡A／J小鼠，隨機分成3組，并分成不同試驗組及對照組，分別經(jīng)4－（甲基亞硝胺基）－1－（3－吡啶）－1－丁酮（NKK）、生理鹽水、植物油及芹菜素進行不同處理，并將小鼠肺部肺片應(yīng)用奧沙利鉑及博來霉素進行處理，取得一定試驗結(jié)果?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥與儀器

動物：選擇鼠齡約5周A／J系健康雄性小鼠140只，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)30 d（基本飼料，自由飲水，12 h晝夜循環(huán)，溫度22℃，相對濕度50% ～70%，定期測體質(zhì)量）后開始試驗，按數(shù)字隨機原則將小鼠分成3組，各40只，每組均按照數(shù)字隨機原則均分成試驗組及對照組。

儀器：ABIPCR擴增儀、PCR System（美國Applied Biosystems公司）；Nanodrop 2000型超微量紫外分光光度計（美國Nanodrop公司）；WY－YW 1664型超低溫冰箱（上海巴玖實業(yè)有限公司）；TGL－16型高速冷凍離心機，TG－16G型常溫高速離心機（常州萬合儀器制造有限公司）；GX41型生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；水平流C型超凈工作臺（上海智誠分析儀器有限公司）；真空采血管、注射器、醫(yī)用剪子、鑷子，均由江蘇康健醫(yī)療用品有限公司提供；ABIN8010560型96孔PCR板，BD－Falcon BD－35型細胞培養(yǎng)板，均由海門市優(yōu)耐特實驗器材發(fā)展有限公司提供。

試藥：NKK（美國 International Laboratory，批號為6004922）；芹菜素（陜西慧科植物開發(fā)有限公司，批號為0510360）；玉米油（江西綠源油脂實業(yè)有限公司）；博來霉素(天津太河制藥有限公司，批號為20060701)，奧沙利鉑(南京制藥廠，批號為20040401)；Invitrogen41500－034型MEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）。

1.2 方法

第1組：40只，隨機分成試驗組及對照組，各20只；適應(yīng)性飼養(yǎng)后第6～7周，試驗組20只給予NKK一次性腹腔注射，10mg／kg；對照組一次性腹腔注射生理鹽水。第52周小鼠稱定質(zhì)量、處死，解剖，肺組織病理檢查。兩組小鼠注射前生長狀態(tài)、體質(zhì)量等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

第2組：60只，隨機分成試驗組及對照組，各30只；適應(yīng)性飼養(yǎng)后第6～7周，試驗組及對照組均給予NKK一次性腹腔注射，10mg／kg；第2～3 d試驗組每日以大劑量芹菜素灌胃（50mg／kg，玉米油稀釋）；每隔5 d，灌胃1次，用量同前；對照組等量玉米油灌胃，灌胃頻率與試驗組保持一致。正常飼養(yǎng)，給水。第52周小鼠稱定質(zhì)量、處死，解剖，肺組織病理檢查。兩組小鼠注射前生長狀態(tài)、體質(zhì)量等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

第3組：40只，隨機分成試驗組及對照組，各20只；適應(yīng)性飼養(yǎng)后第6～7周，試驗組及對照組均給予NKK一次性腹腔注射，10mg／kg。正常飼養(yǎng)，給水。給藥后第52～62周，試驗組在初始2 d均給予大劑量芹菜素灌胃（50mg／kg，玉米油稀釋）；每隔5 d，灌胃1次，用量同前；對照組等量玉米油灌胃，灌胃頻率與試驗組保持一致。第63周，試驗組及對照組小鼠在灌胃給藥5 d后稱定質(zhì)量后處死，解剖，肺組織病理檢查。兩組小鼠注射前生長狀態(tài)、體質(zhì)量等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.3 建模成功標準及 CI測定

建模成功標準：第1組、第2組均為第52周處死小鼠，解剖肺部病理檢查發(fā)現(xiàn)肺癌病灶，可判斷為肺癌模型建立成功，而第3組則在第62周處死小鼠，肺部病理檢查發(fā)現(xiàn)肺癌病灶，可判斷為肺癌造模成功。

抑制率(CI)測定：將肺部腫瘤計數(shù)后、稱重，詳細記錄數(shù)據(jù)，并計算試驗組抑瘤率。將小鼠肺癌細胞在細胞培養(yǎng)板（96孔，每孔1×104）上貼壁后去除培養(yǎng)基，加入芹菜素培養(yǎng)基（DMEM，含抗生素1%）200μmol／L，設(shè)空白及加入二甲基亞砜（DMSO）對照組，經(jīng)過夜處理，去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗；用DMEM培養(yǎng)基對博來霉素及奧沙利鉑進行稀釋，并設(shè)置空白及加入DMSO對照組，1個濃度3個復(fù)孔，培養(yǎng)板上每孔利用200μL藥液進行處理，并在CO2濃度為5%、溫度為37℃培養(yǎng)箱中停留48 h后取出。每孔加入40μL PMS／MTS混合液，并在CO2濃度為5%、溫度為37℃培養(yǎng)箱中停留30～60min后取出，在490 nm波長下檢測培養(yǎng)孔 CI。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 癌性病灶發(fā)生情況

第1組中，試驗組內(nèi)平均發(fā)現(xiàn)（1.35±0.22）個肺癌病灶，對照組未見癌性病灶；第2組中，試驗組僅2只小鼠發(fā)現(xiàn)偶見肺癌病灶，對照組發(fā)現(xiàn)（1.71±1.28）個病灶；第3組中，試驗組發(fā)現(xiàn)（1.01±1.19）個癌性病灶，對照組發(fā)現(xiàn)（1.56±0.78）個癌性病灶。抑制率第1組為0，第2組為（94.32±0.27）%，第3組為（0.36±0.03）%。

2.2 藥物增敏情況

芹菜素與奧沙利鉑、博來霉素存在一定的協(xié)同作用（CI多小于1）。詳見表1。

3 討論

全球約90%肺癌均與吸煙有關(guān)，在歐美等發(fā)達國家中，與吸煙有關(guān)的癌癥患者年死亡率占30%，且每年與吸煙有關(guān)的肺癌患者逐年上升[7－10]。NKK為在煙草中特異性存在的主要致癌物質(zhì)，進入人體后可經(jīng)過一系列反應(yīng)可轉(zhuǎn)化成甲醛及酮酸、二醇等，與DNA極具親和力，能促使DNA發(fā)生癌變[11－12]。利用NKK處理小鼠，較易建立肺癌模型，且多為腺癌。

表1 芹菜素與奧沙利鉑、博來霉素在肺癌細胞中的 CI值

芹菜素的生物學(xué)活性多樣，在眾多哺乳動物系統(tǒng)中其生物效應(yīng)與自身具備的抗氧化作用、清除自由基能力有關(guān)。此外，它還具有抗基因突變、抗炎性反應(yīng)、抗病毒傳染、抑制腫瘤細胞增殖活躍程度、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制細胞周期、減少氧化應(yīng)激程度、提高解毒酶生物活性、提高放化療增敏效應(yīng)等作用。多項體外及動物試驗研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素對多種腫瘤具有預(yù)防、治療或化療增敏作用，且對多種原因?qū)е碌墓?、前列腺、肝臟、眼部等組織、器官的病變具有預(yù)防保護效用，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常病變亦具有一定的預(yù)防作用；對不同性別的的大鼠生殖系統(tǒng)的內(nèi)分泌功能均有明顯影響；還具有抗細菌、抗病毒、抗過敏作用、抗氧化作用、抵抗輻射損傷及調(diào)節(jié)分化功能等作用[13－15]。

NNK是煙草中特有的亞硝胺類（TSNAs）主要致癌源，被公認為造成吸煙患上肺癌的重要危險因素。因此，國際癌癥研究協(xié)會將其列為具有致癌作用的物質(zhì)之一。目前，肺癌患者首選治療手段為化療，但如骨髓抑制等典型化療毒副反應(yīng)限制了其應(yīng)用。因此，近年來尋求更好的中西醫(yī)結(jié)合治療方案，以減少化療的副作用成為相關(guān)領(lǐng)域研究焦點。而芹菜素可直接作用于細胞周期檢測點，且能調(diào)節(jié)細胞周期，進而預(yù)防癌癥。芹菜素能從一定程度上提高肺癌A549細胞中的瘦素與瘦素受體的表達情況，且能單獨或與瘦素協(xié)同上調(diào)活性氧的釋放量，誘導(dǎo)細胞開始凋亡進程。但芹菜素對肺癌的預(yù)防作用具體機制尚不明確，且僅停留在體外試驗中。

本研究結(jié)果顯示，NKK建立肺癌模型成功的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌性病灶明顯少于無芹菜素灌胃的肺癌模型小組。且利用不同濃度芹菜素與奧沙利鉑、博來霉素共同作用于小鼠肺癌病灶，結(jié)果顯示，對藥物的增敏效果良好，CI多小于1。提示NKK能誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)肺癌，奧沙利鉑、博來霉素對肺癌具有一定的治療作用，芹菜素對肺癌具有較強的抑制作用，能提高藥物的敏感性。

綜上所述，芹菜素對肺癌細胞的抗增殖作用和抗腫瘤藥物的增敏作用良好。但本次研究存在一定的局限性，如樣本量不足、試驗動物種類單一等，應(yīng)進一步擴大樣本量，擴展試驗動物種類，滿足研究需要。

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Anti－Proliferative Effect of Apigenin on Lung Cancer Cells and Its Sensitization Effect of Anti－Tumor Drugs

Huang Haowu1，Huang Huanwen2，Jiang Yiping1，Guan Yazi1，F(xiàn)eng Jiacheng1
（1.Department of Pharmacy，Zhuhai People′s Hospital，Zhuhai，Guangdong，China 519000； 2.The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zhuhai，Guangdong，China 519100)

Objective To analyze the anti－proliferative effect of apigenin on lung cancer cells and its sensitization effect of anti－tumor drugs.M ethods Totally 140 A／J mice of 5 weeks were selected and random ly divided into 3 groups，40 mice in the first group，60 mice in the second group，40 mice in the third group，they were divided into the experimental group and the control group according to the digital random principle.In the rats aged 6－7 weeks，the experimental group in the first group and the second groups were intraperitoneally injected with 4－（methyl nitrosamine)－1－ （3－pyridine)－1－ butanone（NKK)10 mg／kg，and the control group in the first group was intraperitoneally injected with physiological saline.On the second and third day，the experimental group in the second group was treated with large doses of apigenin，the third group was given intraperitoneal injection of NKK.In the 52－62 weeks，the experimental groups were given intragastric administration of apigenin at large doses，the control groups in the second group and the third group were treated with large doses of vegetable oil.In the fifty－second week，the mice in the first group and the second group were killed，and the mice in the third group were killed on the fifth day in the sixty－third weeks.The mice in the 3 groups were sacrificed and dissected to observe，and the lung cancer slices were treated with Oxaliplatin and Bleomycin.Resu lts In the first group，an average of（1.35±0.22）lung cancer lesions were found in the experimental group，and there were no cancer lesions in the control group.In the second group，only 2 mice in the experimental group were occasionally found the lung cancer lesions，and（1.71±1.28)cancer lesions were found in the control group.In the third group，（1.01±1.19)cancer lesions were found in the experimental group，and （1.56±0.78)cancer lesions were found in the control group.The CI were 0，（94.32±0.27）% and（0.36±0.03）% in the first，second and third group，respectively.Apigenin combined with Oxaliplatin and Bleomycin had synergistic reaction（CI was mostly less than 1).Conclusion Apigenin plays an important role in the anti－proliferation of lung cancer cells and the sensitizing effect of anti－tumor drugs.

apigenin；lung cancer cells；anti－proliferative；anti－tumor；sensitization

R285.5；R282.71；R734.2

：A

：1006－4931(2017)12－0020－03

2017－01－29；

2017－03－08)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.005

黃好武（1973－），女，大學(xué)本科，副主任藥師，研究方向為醫(yī)院藥學(xué)，（電話）0756－2162181（電子信箱）haowu0922＠126.com。