張緒美，徐政秀，張燕，陳敏，李曉蕾，王丹

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261041；2日照市五蓮縣中醫(yī)醫(yī)院)

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人腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達(dá)變化及其意義

張緒美1，徐政秀2，張燕1，陳敏1，李曉蕾1，王丹1

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261041；2日照市五蓮縣中醫(yī)醫(yī)院)

目的 觀察人腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 采用免疫組化SP二步法檢測(cè)55例份腦膠質(zhì)瘤組織和20例份正常腦組織中的Gab2、IgG、Integrinβ6。分析腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6表達(dá)的相關(guān)性，及Gab2、IgG、Integrinβ6表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 腦膠質(zhì)瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達(dá)陽(yáng)性分別為38(69.0%)、29(52.7%)、45(81.8%)例，正常腦組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達(dá)陽(yáng)性分別為1(5.0%)、1(5.0%)、0例，腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常腦組織(P均<0.05)。腦膠質(zhì)瘤組織中IgG與Gab2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.312 4，P<0.05﹚，IgG與Integrinβ6表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.398 8，P<0.05﹚。腦膠質(zhì)瘤未完整切除者Gab2、IgG、Integrinβ6陽(yáng)性表達(dá)比例高于腫瘤完整切除者，腫瘤直徑>5 cm者Gab2、IgG、Integrinβ6陽(yáng)性表達(dá)比例高于直徑≤5 cm者，腫瘤分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)者Gab2、IgG、Integrinβ6陽(yáng)性表達(dá)比例高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)者(P均<0.05)。結(jié)論 人腦膠質(zhì)瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6呈高表達(dá)，并與腫瘤直徑、腫瘤完整切除情況和腫瘤分級(jí)有關(guān)。IgG、Gab2、Integrinβ6可能協(xié)同參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

腦膠質(zhì)瘤；Gab2蛋白；免疫球蛋白G；整合素β6

腦膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，約占所有顱內(nèi)腫瘤的45%，預(yù)后差。隨著研究的深入，支架蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用漸漸引起學(xué)界關(guān)注。支架蛋白在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究的熱點(diǎn)。Gabs家族蛋白是一類支架蛋白，是細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)的集合平臺(tái)[1]。Gabs蛋白包括Gab1～4多個(gè)家族成員，其中Gab2調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、分化、凋亡、侵襲等生命過(guò)程，具有潛在的原癌基因特性，在人卵巢癌、肺癌、乳腺癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[2～4]。免疫球蛋白G(IgG)是免疫球蛋白的一種，腫瘤源性IgG能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。整合素表達(dá)于惡性上皮性腫瘤組織[6]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著非常密切的關(guān)系。Integrinβ6是整合素家族分子之一。本研究觀察了人腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、濰坊市人民醫(yī)院2011年1月～2013年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本55例份。腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本來(lái)源患者男30例，女25例；年齡11～74歲，中位年齡44歲；按WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ級(jí)(低級(jí)別)25例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)(高級(jí)別)30例。所有標(biāo)本均用甲醛固定，石蠟包埋，做厚4 μm切片。另取20例正常腦組織(腦外傷患者減壓術(shù)中取得)作為對(duì)照，標(biāo)本來(lái)源患者男14例、女6例，年齡20～64歲(中位年齡46歲)。腦膠質(zhì)瘤組與對(duì)照組患者的年齡、性別資料具有可比性。

1.2 試劑與材料 Gab2多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。IgG多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司。Integrinβ6抗體由濰坊醫(yī)學(xué)院李文通博士提供。SP試劑盒、DAB試劑盒、AEC試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物公司，抗體均為工作液。

1.3 Gab2、IgG、Integrinβ6檢測(cè)方法 采用免疫組化SP二步法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的Gab2、IgG、Integrinβ6。將石蠟標(biāo)本做5 μm厚切片，常規(guī)脫蠟入水，熱抗原修復(fù)，免疫組化SP法染色，Gab2、Integrinβ6兩種抗體DAB鏡下控制顯色，IgG抗體AEC鏡下控制顯色。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒為IgG陽(yáng)性，以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Gab2陽(yáng)性，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Integrinβ6陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%計(jì)0分，5%～<25%計(jì)1分，25%～<50%計(jì)2分，≥50%計(jì)3分；細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分，淺棕黃色(淡紅色)計(jì)1分，棕黃色(紅色)計(jì)2分，棕褐色(深紅色)計(jì)3分；兩項(xiàng)得分相加，0～1分為蛋白表達(dá)陰性，≥2分為蛋白表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6表達(dá)變化及其相關(guān)性 腦膠質(zhì)瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達(dá)陽(yáng)性分別為38(69.0%)、29(52.7%)、45(81.8%)例，正常腦組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達(dá)陽(yáng)性分別為1(5.0%)、1(5.0%)、0例，腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常腦組織(P均<0.05)。腦膠質(zhì)瘤組織中IgG與Gab2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.312 4，P<0.05﹚，IgG與Integrinβ6表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.398 8，P<0.05﹚。

2.2 Gab2、IgG、Integrinβ6表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤未完整切除者Gab2、IgG、Integrinβ6陽(yáng)性表達(dá)比例高于腫瘤完整切除者，腫瘤直徑>5 cm者Gab2、IgG、Integrinβ6陽(yáng)性表達(dá)比例高于直徑≤5 cm者，腫瘤分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)者Gab2、IgG、Integrinβ6陽(yáng)性表達(dá)比例高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)者(P均<0.05)。詳見表1。

3 討論

彌漫浸潤(rùn)性生長(zhǎng)是腦膠質(zhì)瘤的顯著特征，手術(shù)難以切除或根本無(wú)法手術(shù)。膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此，研究膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)是膠質(zhì)瘤治療中迫切需要解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，支架蛋白的結(jié)構(gòu)及功能成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。支架蛋白是底物分子，它們能與酪氨酸激酶結(jié)合，發(fā)揮聯(lián)系各種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)蛋白之間交互調(diào)控的功能，并可以放大信號(hào)的傳導(dǎo)，含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域和錨定位點(diǎn)[1]。作為一類支架蛋白，Gab2是Gabs家族中的重要成員。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Gab2具有潛在的原癌基因特性，常在人類乳腺癌、卵巢癌、肺癌中高表達(dá)，并且其表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。多項(xiàng)研究表明，Gab2調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、侵襲遷移等過(guò)程。對(duì)肺癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，Gab2可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的侵襲能力[8]。但是到目前為止，Gab2在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及作用機(jī)制罕見報(bào)道。

表1 Gab2、IgG、Integrinβ6表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

孫磊等[9]報(bào)道應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)降低Gab2表達(dá)使膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN-229侵襲轉(zhuǎn)移能力降低，說(shuō)明Gab2與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。另有研究[10]報(bào)道，腫瘤抑制因子miRNA-302a可通過(guò)抑制Gab2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和入侵能力。本研究結(jié)果顯示，Gab2在正常腦組織中低表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，并且隨著臨床分級(jí)增高、腫瘤直徑增大其表達(dá)也增高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說(shuō)明Gab2的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病、惡性進(jìn)展有關(guān)，Gab2有望作為預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)，并可能成為一個(gè)抗膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。IgG是免疫球蛋白的一種。腫瘤細(xì)胞分泌的IgG是一種新發(fā)現(xiàn)的分子，主要來(lái)源于上皮源性腫瘤細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移、局部侵入和患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。Chen等[11]證實(shí)上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞分泌的IgG能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存。在結(jié)直腸癌組織中，IgG的表達(dá)與腫瘤的惡性程度(包括分化程度、Dukes分期)具有顯著相關(guān)性，即結(jié)直腸癌分化程度越差、Dukes分期越高，IgG表達(dá)量越高[12]。最近，Lv等[13]發(fā)現(xiàn)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞中IgG表達(dá)，并且IgG表達(dá)越高，腫瘤細(xì)胞之間的黏附性越低，其浸潤(rùn)侵襲能力越強(qiáng)。本研究中我們觀察到，IgG在正常腦組織中低表達(dá)，在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，且隨著腦膠質(zhì)瘤惡性度的增加，IgG表達(dá)水平逐漸升高，提示IgG異常高表達(dá)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性增殖[14]。另外，Xu等[15]在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IgG對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、遷移和入侵具有增強(qiáng)作用；通過(guò)小干擾RNA技術(shù)抑制前列腺癌細(xì)胞中IgG的表達(dá)后，細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA表達(dá)降低，凋亡標(biāo)志物Caspase-3表達(dá)增高，認(rèn)為IgG是前列腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

整合素家族是細(xì)胞表面的黏附分子，常表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞之間及細(xì)胞與外界之間的信號(hào)傳導(dǎo)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。趙艷霞等[16]報(bào)道整合素家族成員α6可能與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性增殖和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。近年來(lái)，以Integrinβ6為靶點(diǎn)的靶向治療為結(jié)腸癌的臨床治療提供了新的方向[17]。研究[18]證實(shí)，通過(guò)小干擾RNA技術(shù)抑制Integrinβ6基因表達(dá)后，可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，Integrinβ6在正常腦組織中不表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，隨著腦膠質(zhì)瘤分級(jí)升高、腫瘤直徑增大、腫瘤切除難度增大，其表達(dá)也升高，這提示Integrinβ6表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切，檢測(cè)Integrinβ6可能對(duì)評(píng)估膠質(zhì)瘤患者預(yù)后具有一定價(jià)值，Integrinβ6也有望成為腦膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果還顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中IgG表達(dá)與Gab2、Integrinβ6表達(dá)均呈正相關(guān)，提示三者之間存在一定相互作用，共同參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。對(duì)這一現(xiàn)象繼續(xù)深入研究，有望為腦膠質(zhì)瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療提供新的思路。

[1] Nishida K, Hirano T. The role of Gab family scaffolding adapter proteins in the signal transduction of cytokine and growth factor receptors[J]. Cancer Sci, 2003,94(12):1029-1033.

[2] Wang Y, Sheng Q, Spillman MA, et al. Gab2 regulates the migratory behaviors and E-cadherin expression via activation of the PI3K pathway in ovarian cancer cells[J]. Oncogene, 2012,31(20):2512-2520.

[3] Xu XL, Wang X, Chen ZL, et al. Overexpression of Grb2-associated binder 2 in human lung cancer[J]. Int J Biol Sci, 2011,7(5):496-504.

[4] Bocanegra M, Bergamaschi A, Kim YH, et al. Focal amplification and oncogene dependency of GAB2 in breast cancer[J]. Oncogene, 2010,29(5):774-779.

[5] Kyrou IE, Papakostas JC, Ioachim E, et al. Early ischaemic preconditioning of spinal cord enhanced the binding profile of heat shock protein 70 with neurofilaments and promoted its nuclear translocation after thoraco-abdominal aortic occlusion in pigs[J]. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2012, 43(4):408-414.

[6] Arihiro K, Kaneko M, Fujii S, et al. Significance of alpha 9 beta 1 and alpha v beta 6 integrin expression in breast carcinoma[J]. Breast Cancer,2000,7(1):19-26.

[7] Bocanegra M, Bergamaschi A, Kim YH, et al. Focal amplification and oncogene dependency of GAB2 in breast cancer[J].Oncogene, 2010,29(5):774-779.

[8] 史立宏,陶蓉,王云甲，等.Gab2對(duì)人肺癌細(xì)胞A549侵襲能力影響及其機(jī)制的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(16):1207-1211.

[9] 孫磊,劉雨清,李小龍,等.Gab2-Akt-ARK5通路在膠質(zhì)瘤侵襲中的研究[J].中國(guó)腫瘤臨床,2014(9):551-554.

[10] Ma J, Yu J, Liu J, et al. MicroRNA-302a targets GAB2 to suppress cell proliferation, migration and invasion of glioma[J]. Oncol Rep, 2017,37(2):1159-1167.

[11] Chen Z, Qiu X, Gu J.Immunoglobulin expression in non-lymphoid lineage and neoplastic cells[J]. Am J Pathol, 2009,174(4):1139-1148.

[12] Niu N, Zhang J, Huang T, et al. IgG expression in human colorectal cancer and its relationship to cancer cell behaviors[J]. PLoS One, 2012,7(11):e47362.

[13] Lv WQ, Peng J, Wang HC, et al. Expression of cancer cell-derived IgG and extra domain a-containing fibronectin in salivary adenoid cystic carcinoma[J]. Arch Oral Biol, 2017,21(81):15-20.

[14] 薛雨健,張杰,汪明玉,等.IgG在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與OPN、MMP-2、MMP-9、P16的關(guān)系[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2013,19(6):513-515,519.

[15] Xu Y, Chen B, Zheng S, et al. IgG silencing induces apoptosis and suppresses proliferation, migration and invasion in LNCaP prostate cancer cells[J]. Cell Mol Biol Lett, 2016,3(21):27.

[16] 趙艷霞,孫華平,陳勝,等.Integrin α6在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].腫瘤防治研究,2013(7):656-659.

[17] Liang B, Shahbaz M, Wang Y, et al. Integrinβ6-targeted immunoliposomes mediate tumor-specific drug delivery and enhance therapeutic efficacy in colon carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2015,21(5):1183-1195.

[18] Song L, Fan Z, Jun N, et al. Tumor specific delivery and therapy mediate by integrin β6-target immunoliposomes for β6-siRNA in colon carcinoma[J]. Oncotarget, 2016,7(51):85163-85175.

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015ws0054)；濰坊市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目計(jì)劃(2014011)；濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院青年創(chuàng)新基金(K12QC1002)。

張緒美(E-mail：zhang2005033@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.018

R739.41

B

1002-266X(2017)27-0061-03

2017-03-24)